REVISTA ARGENTINA DE CIRUGÍA CARDIOVASCULAR
Vol. III - N° 2 / Junio - Julio - Agosto 2005

ARTÍCULO ORIGINAL
LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Y LAS SUBPOBLACIONES DE CELULAS T

Autores
Carmen E. Fuenmayor*, María L. Higuchi†, Hugo Carrasco*, Maryori García*, Marcia M. Reis†, Julia Silvestre†, Vera Aiello†

Recibido:               28.04.2005
Aceptado:              19.05.2005
Correspondencia:   Carmen Elena Fuenmayor
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                            Mérida Edo, Mérida, Venezuela.
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                            Fax: 0274-2403217
                            E-Mail: carmenelena46@hotmail.com
                                                     
                            

* Instituto de Investigaciones Cardiovasculares de la Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela.
† Instituto do Coração (InCor), São Paulo, Brasil.

RESUMEN

   Se revisaron 54 biopsias endomiocárdicas de pacientes chagásicos, controlados en el Instituto de Investigaciones cardiovasculares de la Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela, y el Instituto do Coração (InCor), São Paulo, Brasil, con la finalidad de conocer las diferentes subpoblaciones de células linfoides tipo T CD4+ y CD8+, las cuales podrían ser las responsables de la proliferación del parásito y del desarrollo de miocarditis con falla cardíaca crónica. Se cuantificaron estas células y los antígenos T. cruzi, utilizando inmunohistoquímica. Los pacientes fueron clasificados en cuatro grupos: A, fase aguda; B, forma crónica indeterminada; C, forma crónica con arritmia, y D, forma crónica con insuficiencia cardíaca.
   Los grupos A, B, C y D presentaron, respectivamente, miocarditis: 100%, 10%, 40% y 45%; antígenos T. cruzi positivos: 58%, 0%, 10% y 0%; relación entre células T CD4+ y CD8+: 0,75, 0,90, 1,17 y 0,79. El test de correlación de Pearson fue altamente significante en los grupos A y B para las células T CD4+ y CD8+, pero no para los grupos C y D.
     En conclusión, la fase aguda está caracterizada por una respuesta inmunológica de células T CD4+ y CD8+ balanceada, asociada con la presencia de antígenos T. cruzi. La forma indeterminada presenta menor número de miocarditis con respuesta inmunológica balanceada. Las formas crónicas restantes están asociadas con miocarditis sin relación entre las células T CD4+ y CD8+. Esta respuesta inmunológica desbalanceada podría contribuir a la persistencia de miocarditis crónica activa y a la injuria de las fibras miocárdicas no infectadas.
   (Rev Arg Cir Cardiovasc 2005; 3:64-70)

Palabras clave
Biopsia endomiocárdica - Enfermedad de Chagas - Linfocitos T - Fase aguda - Fase crónica

RESUMO

A DOENÇA DE CHAGAS E AS SUBPOPULAÇÕES DE CÉLULAS T

   Foram revisadas 54 biópsias endomiocárdicas de pacientes chagásicos, controlados no Instituto de Investigações Cardiovasculares da Universidade de los Andes, Mérida, Venezuela, e no Instituto do Coração (InCor), São Paulo, Brasil, com a finalidade de conhecer as diferentes subpopulações de células linfóides do tipo T CD4+ e CD8+, as quais poderiam ser responsáveis pela a proliferação do parasito e do desenvolvimento de miocardite com falha cardíaca crônica. Quantificaram-se essas células e os antígenos T. cruzi, utilizando imunohistoquímica. Os pacientes foram classificados em quatro grupos: A, fase aguda; B, forma crônica indeterminada; C, forma crônica com arritmia, e D, forma crônica com insuficiência cardíaca.
   Os grupos A, B, C e D apresentaram, respectivamente, miocardite: 100%, 10%, 40% e 45%; antígenos T. cruzi positivos: 58%, 0%, 10% e 0%; relação entre células T CD4+ e CD8+: 0,75, 0,90, 1,17 e 0,79. O teste de correlação de Pearson foi altamente significante nos grupos A e B para as células T CD4+ e CD8+, embora não tenha sido para os grupos C e D.
   Como conclusão, a fase aguda está caracterizada por uma resposta imunológica de células T CD4+ e CD8+ balançada, associada com a presença de antígenos T. cruzi. a forma indeterminada apresenta menor número de miocardite com resposta imunológica balançada. As formas crônicas restantes estão associadas com miocardite sen relação entre as células T CD4+ e CD8+. Esta resposta imunológica desbalançada poderia contribuir à persistência de miocardite crônica ativa e à injúria das fibras miocárdicas não infectadas.
   (Rev Arg Cir Cardiovasc 2005; 3:64-70)

Palavras-chave
Biópsia endomiocárdica - Doença de Chagas - Linfócitos T - Fase aguda - Fase crônica

SUMMARY

CHAGAS’ DISEASE AND SUBSETS T CELL

   The present work reviewed endomyocardial biopsy specimens taken in the Instituto de Investigaciones Cardiovasculares de la Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela, and Instituto do Coração, São Paulo, Brasil, from 1986 to 1998 and, looking for different CD4+/CD8+ T cell ratios in patients with chronic heart failure. For immunohistochemistry, T. cruzi antigens and CD4+ and CD8+ T cells in paraffin histological sections were quantified. The sections came from 4 groups of chagasic patients: A, Acute phase (12 pts); B, Indeterminate form (21 pts); C, Cardiac form with arrhythmia (10 pts); and D, Chronic heart failure (11 pts).
   Groups A, B, C and D presented respectively: 100%, 10%, 40% and 45% of myocarditis; 58%, 0%, 10% and 0% with T. cruzi (+) antigens; with a mean CD4+/CD8+ T cell ratio of 0,75, 0,90, 1,17 y 0,79. The Pearson Correlation Test between mean numbers of CD4+ T and CD8+ T cells was high in groups A and B but not in groups C and D.
   Acute phase is characterized by myocardial inflammatory infiltrate with a balanced CD4+/CD8+ T cell immune response, associated with presence of parasite antigens. Indeterminate phase shows a lesser degree of myocarditis and balanced T cell immune response. Chronic cardiac forms are associated with myocarditis, but the quantity of T. cruzi antigens is much smaller and not detected by biopsy; an unbalanced immune response, with low CD4+/CD8+ T cell ratio, may be contributing to the persistence of active chronic myocarditis and injury of non-infected myocardial fibers.
   (Rev Arg Cir Cardiovasc 2005; 3:64-70)

Key words
Endomyocardial biopsy - Chagas’ disease - T lymphocytes - Acute phase - Chronic phase

INTRODUCCIÓN

   La enfermedad de Chagas continúa siendo un problema de salud pública en muchos países de América del Sur. En Venezuela, su incidencia se ha incrementado en los últimos años (1). Una de las características más intrigantes de la enfermedad es por qué sólo alrededor del 30% de los pacientes que adquiere la infección con el parásito se hace sintomático después de décadas de la fase aguda. Algunos investigadores han sugerido la importancia de determinar si hay alguna relación entre el tipo de zymodene del Tripanosoma cruzi y la severidad de la enfermedad de Chagas (2).
   La principal manifestación de la enfermedad es la cardiopatía chagásica, la cual está presente tanto en la fase aguda como en la crónica. Otros trabajos reportan hallazgos histológicos en pacientes con enfermedad de Chagas crónica, los cuales demuestran que la miocarditis aparece como un proceso continuo, asociado con necrosis, infiltrado inflamatorio y fibrosis, el cual actúa progresivamente y continúa después de la fase aguda. Estas investigaciones concluyen que la miocarditis es siempre observable en pacientes en los diferentes estados de la enfermedad (3). Por otra parte, antígenos parasitarios han sido detectados en el miocardio de los pacientes con miocarditis moderada a severa, favoreciendo la idea de que el parásito tiene un papel fundamental en la persistencia de la miocarditis crónica. Asimismo, es muy probable que exista alguna respuesta inmune anormal responsable del daño e injuria de las fibras miocárdicas (4-5).
   En el presente trabajo se comparará la relación existente entre las células T CD4+ y CD8+ observada en las biopsias endomiocárdicas (BEM) de los pacientes chagásicos en sus diferentes fases clínicas, para detectar alguna respuesta inmunológica alterada.

CASUÍSTICA Y MÉTODOS

   El protocolo de este trabajo fue evaluado y aprobado por la Comissão Científica e de Ética do Instituto do Coração do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo y el Instituto de Investigaciones Cardiovasculares de la Universidad de los Andes. El presente trabajo se realizó en el Instituto do Coração (InCor) de la Universidad de São Paulo, Brasil, en conjunto con la Universidad de los Andes de Mérida, Venezuela.

CASUÍSTICA

   Examinamos un total de 54 BEM, de pacientes controlados en el Instituto de Investigaciones Cardiovasculares de la Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela, y el Instituto do Coração (InCor), São Paulo, Brasil, durante los años 1986 a 1998. Las biopsias se obtuvieron a través de la técnica de rutina del séptum interventricular (6). Los pacientes fueron clasificados en los siguientes subgrupos: A, agudos: 12 pacientes (7 hombres y 5 mujeres); B, forma crónica indeterminada: 21 pacientes (12 hombres y 9 mujeres); C, forma crónica arritmogénica: 10 pacientes (4 hombres y 6 mujeres); y D, forma crónica congestiva: 11 pacientes (9 hombres y 2 mujeres).
   Como criterio de inclusión se consideró la presencia de un mínimo de 10 campos de 400X en cada lámina.
   El grupo A (fase aguda) estuvo constituido por 12 pacientes, 7 hombres (58%) y 5 mujeres (42%), con edades comprendidas entre 12 y 51 años, todos habitantes de la zona endémica de Barinas, Venezuela. El cuadro clínico se caracterizó por fiebre, signo de Romaña, alteraciones electrocardiográficas y, ocasionalmente, síntomas de insuficiencia cardíaca. Ocho (67%) pacientes tuvieron demostración directa de parásitos en sangre y las pruebas serológicas -Machado-Guerreiro, hemoaglutinación, inmunofluorescencia y ELISA- fueron positivas en todos los casos.
   El grupo B (forma crónica indeterminada) estuvo constituido por pacientes moradores de la región endémica de Barinas, asintomáticos, con edades comprendidas entre 21 y 67 años, cuyos electrocardiogramas (ECG) de reposo y estudios radiológicos de tórax eran normales. Las pruebas serológicas anteriormente mencionadas fueron positivas en todos los pacientes. El grupo C (forma crónica cardíaca con arritmias) estuvo constituido por 10 pacientes, 4 hombres (40%) y 6 mujeres (60%), con edades entre 35 y 63 años, habitantes de los estados Barinas y Zulia. Uno de los integrantes de este grupo C era habitante de Pernambuco, Brasil. Un mínimo de 2 pruebas serológicas citadas anteriormente fueron positivas y todos presentaron sintomatología clínica, como palpitaciones y mareos. El ECG estuvo alterado en todos los pacientes, con presencia de extrasístoles ventriculares, bloqueo completo de la rama derecha, bloqueo divisional antero-septal de la rama izquierda y/o bloqueo atrio-ventricular de primer grado.
   El grupo D (forma crónica cardíaca congestiva) estuvo constituido por 11 pacientes, 9 hombres (82%) y 2 mujeres (18%), con edades entre 39 y 70 años. Ocho de estos pacientes eran habitantes de algunos estados de Brasil y controlados en el Instituto do Coração (InCor), São Paulo, Brasil. Un mínimo de 2 pruebas serológicas para T. cruzi fueron positivas. Todos los pacientes presentaron sintomatología de insuficiencia cardíaca clase IV, con alteraciones electrocardiográficas diversas.

MÉTODOS

   A partir de los bloques de parafina se realizaron cortes seriados de 4 micras de espesor para microscopia óptica convencional e inmunohistoquímica. Utilizando la coloración de H&E, Miller e inmunohistoquímica se realizó evaluación cualitativa y semicuantitativa de las lesiones inflamatorias. El grado de miocarditis se evaluó conforme con los criterios utilizados en el servicio de Anatomía Patológica de InCor, que considera la agresión de las fibras cardíacas y la presencia e intensidad del infiltrado inflamatorio (7).
   La fibrosis intersticial fue valorada mediante la técnica de Miller (8). En el procedimiento para inmunohistoquímica se utilizó el método de inmunoperoxidasa mediante streptavidina-biotina-peroxidasa y los anticuerpos primarios anti T. cruzi (policlonal) (5) y antilinfocitos T CD4+ y CD8+ (monoclonales) (9-10). El suero inmune anti T. cruzi fue producido en conejo por el Profesor Dr. Renato Mortara, del Departamento de Parasitología de la Escuela Paulista de Medicina, Universidad Federal de São Paulo. La dilución utilizada fue de 1/4.5005. Para los anticuerpos CD4+ y CD8+, la dilución fue de 1/60 de la marca Novocastra (Reino Unido) (9-10).
   Como control positivo de las reacciones CD4+ y CD8+, se utilizaron secciones de amígdala humana, producto de amigdalectomía por procesos inflamatorios. Para la reacción anti T. cruzi, el control se obtuvo de la autopsia de un niño de 1 año de edad fallecido por enfermedad de Chagas agudo, cuyo reporte histológico señalaba la presencia de nidos de parásitos.
   El análisis semicuantitativo para la presencia de antígenos T. cruzi se realizó según trabajos anteriores (5). Las subpoblaciones de linfocitos CD4+ y CD8+ fueron evaluadas mediante la cuantificación celular en campos de 400X, considerando un mínimo de 10 campos (9-10).
   Para el análisis estadístico se utilizó el test de Fisher para la variable inflamación, análisis de varianza para las variables CD4+ y CD8+ y el test de correlación de Pearson para la relación entre CD4+/CD8+. Todos los resultados fueron analizados por el sistema SAS (Statistical Analysis System) (11-15).

RESULTADOS

   Hubo diferencia estadística significativa entre los diferentes grupos estudiados para la variable total miocarditis (p=<0,01). Las biopsias del grupo A mostraron lesión celular y agresión de las fibras por el infiltrado inflamatorio en un 100% de los casos. Estos hallazgos fueron clasificados como miocarditis en sus diferentes grados de actividad: miocarditis leve (5 casos), miocarditis moderada (3 casos) y miocarditis intensa (4 casos). Para el grupo B, el número de miocarditis fue de 2 casos (10%) con leve actividad. En el grupo C, el número de miocarditis fue de 4 casos (40%) con leve actividad y en el grupo D hubo un total de 5 casos de miocarditis (45%): 3 casos con leve actividad y 2 casos con moderada actividad.
   La reacción anti T. cruzi fue positiva en un 58% de las BEM del grupo agudo, observándose nidos de amastigotas y antígenos anti T. cruzi en 2 casos y sólo antígenos en 5 casos. El grupo B (forma indeterminada) y el grupo D (insuficiencia cardíaca) fueron negativos, y sólo 1/10 del grupo C (forma arritmogénica) mostró antígenos anti T. cruzi.
   Con relación a las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+, no hubo diferencia estadísticamente significativa. Se obtuvieron los siguientes resultados: para el grupo A la media de linfocitos total fue de 25,69, con una media de subpoblación para CD8+ de 14,69, CD4+ de 11,00 y relación CD4+/CD8+ de 0,75 linfocitos. Para el grupo B, el número medio de linfocitos totales fue de 3,88 con una media para las subpoblaciones CD4+ de 1,84 y CD8+ de 2,05, y una relación CD4+/CD8+ de 0,90 linfocitos. Los casos que presentaron miocarditis en este grupo mostraron predominio individual para las subpoblaciones CD4+.
   Para el grupo C, el número medio total de linfocitos fue de 7,88, con una media para las subpoblaciones CD4+ de 4,14 y CD8+ de 3,53, con relación CD4+/CD8+ de 1,17 linfocitos. Para el grupo D, el número medio total de linfocitos fue de 7,47, con una media para las subpoblaciones CD4+ de 3,30 y CD8+ de 4,17, con relación CD4+/CD8+ de 0,79 linfocitos.
   Sólo para los grupos A y B la correlación de Pearson fue altamente significativa entre el número de células T CD4+ y CD8+ (r=0,91; p=<0,01); (r=0,82; p=<0,01). Por el contrario, no hubo correlación en los grupos C y D para esta variable (r=0,44; p=0,20), (r=0,42; p=0,18). Estos datos pueden ser observados en la Tabla 1.

DISCUSIÓN

   La BEM realizó grandes contribuciones para el entendimiento de la patogénesis de la enfermedad de Chagas, al permitir caracterizar hallazgos histológicos variables para cada fase. Muchos trabajos en la literatura han utilizado la biopsia con el propósito de conocer mejor la patogenia de la enfermedad y, en consecuencia, actuar más adecuadamente en el tratamiento (2-7,9-10). En el presente trabajo realizamos un estudio retrospectivo del material de biopsia ya previamente analizado, con la intención de caracterizar en profundidad las alteraciones morfológicas presentes en las diferentes fases de la enfermedad de Chagas.
   En la fase aguda (grupo A), encontramos la mayor incidencia de miocarditis (100%) con el mayor porcentaje de positividad para antígenos T. cruzi (58%) y un elevado promedio de células CD4+ (11,00) y CD8+ (14,69). La correlación de Pearson fue altamente significativa para el número de células T CD4 y CD8 (r=0,91; p=<0,01); (r=0,82; p=<0,01). Estos hallazgos muestran una estrecha relación entre estas alteraciones histológicas. El daño a la fibra miocárdica, aunado a la gran cantidad de antígenos T. cruzi podría explicar por qué la miocarditis en la fase aguda es más intensa, con gran proliferación de ambas células T CD4+ y CD8+.
   Estos resultados podrían soportar el concepto de agresión del parásito en la fase aguda y su efecto sobre el sistema inmunológico de los pacientes, el cual podría, progresivamente, inducir mecanismos de autoinmunidad o hipersensibilidad a productos antigénicos, liberados por el parásito cuando lesiona las células. La sobrevida del parásito podría resultar de su interacción con el sistema inmunológico del paciente.
   Por otra parte, esta injuria inflamatoria desencadena daños profundos e intrínsecos a nivel de la fibra cardíaca que podrían desencadenar falla cardíaca. En un trabajo realizado por Higuchi y col. (16) se demostró cómo es que el infiltrado inflamatorio que lesiona las fibras cardíacas tiene estrecha relación con el daño miocárdico que lleva a insuficiencia cardíaca crónica.
   La forma indeterminada (grupo B) presentó miocarditis leve (10%), con ausencia de antígenos T. cruzi y un número balanceado de linfocitos T CD4+ y CD8+. La correlación de Pearson entre estas células fue altamente significativa (r=0,82; p=<0,01).
   Algunos trabajos reportan alteraciones inespecíficas en la fase indeterminada (3,17-18), pero sólo algunos pacientes desarrollan enfermedad cardíaca. Nuestros resultados también muestran hallazgos histológicos interesantes: 10% de miocarditis y un número de células T con proporción altamente significativa y balanceada. En tal sentido, pensamos que sólo algunos de los pacientes que integran esta fase desarrollan enfermedad cardíaca, lo cual dependerá de una respuesta inmunológica balanceada.
   Los resultados obtenidos en las formas chagásicas crónicas con sintomatología cardíaca más evidente fueron los siguientes: el grupo C presentó un 40% de miocarditis leve y el grupo D un 45% de miocarditis leve y moderada, con un 10% de positividad para antígenos T. cruzi. No hubo correlación entre estos grupos para la variable CD4 y CD8 (r=0,44; p=0,20), (r=0,42; p=0,18).
   Con respecto a la presencia de miocarditis y la positividad para antígenos T. cruzi, varios trabajos científicos realizados utilizando material cardíaco de pacientes chagásicos en fase crónica demuestran la relación existente entre estos antígenos T. cruzi y las alteraciones cardíacas causadas por el infiltrado inflamatorio (5,9,19). Si analizamos los resultados obtenidos en nuestro grupo C (grupo arritmogénico), con presencia de miocarditis y positividad para antígenos T. cruzi; y en el grupo D (congestivo), con presencia de miocarditis, pero sin positividad para los antígenos T. cruzi, podríamos pensar que hay incongruencia con los resultados anteriores; pero debemos considerar que estos trabajos que relatan positividad para el antígeno T. cruzi fueron realizados utilizando biopsias quirúrgicas o mapeando corazones obtenidos de necropsias (5, 9, 19-20).
   De igual forma, debemos considerar que la ausencia de positividad para los antígenos T. cruzi, en nuestro tipo de material (BEM), no limita la posibilidad de patogenia del parásito (20). Esto nos hace pensar que la proliferación parasitaria es mayor en los pacientes que están en malas condiciones y que, lamentablemente, mueren por esta causa. Es decir que la persistencia del parásito puede, progresiva y lentamente, conducir al desbalance del sistema inmunológico. Es más, sobre la base de nuestros resultados podríamos especular que la evolución de los pacientes que van hacia la forma arritmogénica o de insuficiencia cardíaca está acompañada por algún grado de miocarditis, pero con un número mayor de células T CD8+, en relación con las células T CD4+. Esto indica que la respuesta inmune en esos pacientes no es adecuada, ya que la proliferación de células T CD4+ es esencial para una normal activación del sistema inmune.
   En resumen, podemos concluir que la enfermedad de Chagas, tanto en fase aguda como en fase crónica, está acompañada por miocarditis, constituida por células linfocitos T. Sin embargo, la miocarditis en la forma aguda es mas intensa y presenta gran cantidad de antígenos T. cruzi, con proliferación de ambas subpoblaciones de células T CD4 y CD8. En la forma indeterminada, la miocarditis usualmente está ausente y los linfocitos presentes en el miocardio mantienen la relación entre las células CD4 y CD8. Los pacientes chagásicos crónicos en fase arritmogénica y con insuficiencia cardíaca presentan con frecuencia miocarditis linfocítica crónica, caracterizada por un alto número de células T CD8+ y un relativo bajo número de células T CD4+, lo cual podría representar una respuesta inmune anormal contra los antígenos T. cruzi. La proliferación inadecuada de células T CD4+, con un gran número de células T CD8+, podría ser la responsable de la presencia de miocarditis crónica, al atacar células cardíacas no infectadas.

AGRADECIMIENTOS

   Agradecemos al Dr. Paulo Gutierrez Sampaio, Dra. Jussara Castelli, Lic. Suely Palomino y Lic. Nadia Sambiase del Instituto do Coração (InCor), São Paulo, Brasil, por la colaboración prestada.

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