REVISTA ARGENTINA DE CIRUGÍA CARDIOVASCULAR
Vol. II - N°3 / Setiembre - Octubre - Noviembre 2004

ARTÍCULO ORIGINAL
APROXIMACIÓN A UNA NUEVA COMPRENSIÓN DE LA ARTERIOSCLEROSIS: INFECCIONES ASOCIADAS CON CHLAMYDIA Y MYCOPLASMA Y BAJA INMUNIDAD

RESUMEN

   En las últimas décadas, la idea concebida por Virchow en 1856 de que la arteriosclerosis podría ser un proceso inflamatorio del vaso(1) retornó a ser considerada, ahora con nuevos enfoques por el uso de técnicas de biología celular y molecular(2). En esta nueva concepción, las lipoproteínas tendrían un papel fundamental, puesto que éstas entrarían y se acumularían en el espacio subendotelial por una disfunción de la célula endotelial. El descubrimiento de la vía metabólica(3) y de los receptores LDL(4), y la hipótesis oxidativa de la arteriosclerosis(5) contribuyeron para el concepto actual de que ésta es una enfermedad inflamatoria.
   Partículas de colesterol que ingresan al interior de la pared del vaso, se oxidarían y llevarían a la activación de macrófagos y el desarrollo de la inflamación, con aumento de citocinas y radicales libres de oxígeno. En los últimos años, agentes infecciosos o sus productos han sido señalados como posibles participantes en la inducción de inflamación, tanto en el desarrollo de la placa de ateroma como en su inestabilidad6, 7, pero con resultados discutibles(8, 9).
   En una secuencia de trabajos realizados en el laboratorio de Patología del InCor, verificamos co-infección en el tejido por Mycoplasma pneumoniae y Chlamydia pneumoniae en placas arterioscleróticas, cuya cantidad se relaciona con la intensidad de la inflamación. Analizamos este aspecto tanto en la placa arteriosclerótica estable y en la placa rota asociada a infarto del miocardio, como en placas iniciales que caracterizan el comienzo de la aterogénesis. Estudiamos también el suero circulante buscando detectar posibles diferencias morfológicas en el suero de pacientes de edad avanzada con y sin arteriosclerosis que pudiesen estar relacionadas con la presencia de estos agentes infecciosos. Estudiamos también si en la arteriosclerosis acelerada del trasplante cardíaco podría haber elevación de estos elementos en el vaso ya que hay importante inmunodepresión en este procedimiento terapéutico.
   Así, la presente revisión es un resumen de este conjunto de trabajos que buscan certificar con datos anátomo-patológicos la tesis de que agentes infecciosos participan activamente en la aterogénesis humana. (Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 3:156-63)

Palabras clave
Arteriosclerosis - Chlamydia - Mycoplasma

RESUMO

APROXIMAçãO A UMA NOVA COMPREENSãO DA ARTERIOSCLEROSE: INFECçõES ASSOCIADAS COM CHLAMYDIA & MYCOPLASMA E BAIXA IMUNIDADE

   Nas últimas décadas, a idéia concebida por Virchow em 1856 de que a arteriosclerose poderia ser um processo inflamatório do vaso (1) retornou a ser considerada, agora com novos enfoques pelo uso de técnicas de biologia celular e molecular (2). Nesta nova concepção, as lipoproteínas teriam um papel fundamental, pois entrariam e se acumulariam no espaço subendotelial por uma disfunção da célula endotelial. O descobrimiento da via metabólic a(3) e dos receptores LDL (4), e a hipótese oxidativa da arteriosclerose5 contribuíram para o conceito atual de que é uma doença inflamatória.
   Partículas de colesterol que ingressam no interior da parede do vaso, oxidariam-se e levariam à ativação de macrófagos e ao desenvolvimento da inflamação, com aumento de citocinas e radicais livres de oxigênio. Nos últimos anos, agentes infecciosos ou seus produtos tem sido indicados como possíveis participantes na indução de inflamação, tanto no desenvolvimento da placa de ateroma quanto na sua instabilidade (6, 7), porém com resultados discutíveis (8, 9).
   Em uma seqüência de estudos realizados no laboratório de Patología do InCor, verificamos co-infecção no tecido por Mycoplasma pneumoniae e Chlamydia pneumoniae em placas arterioscleróticas, cuja quantidade se relaciona com a intensidade da inflamação. Analisamos este aspecto tanto na placa ateriosclerótica estável e na placa rota associada a infarto do miocárdio, quanto em placas iniciais que caracterizam o começo da aterogênese. Estudamos também o soro circulante buscando detectar possíveis diferenças morfológicas no soro de pacientes de idade avançada com e sem arteriosclerose que pudessem estar relacionadas com a presença destes agentes infecciosos. Estudamos também se na arteriosclerose acelerada do trasplante cardíaco poderia haver elevação destes elementos no vaso, visto que há importante imunodepressão neste procedimento terapêutico.
   Assim, a presente revisão é um resumo deste conjunto de trabalhos que buscam certificar com dados anátomo-patológicos a tese de que agentes infecciosos participam ativamente na aterogênese humana. (Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 3:156-63)

Palavras chave
Arteriosclerose - Mycoplasma - Chlamydia

SUMMARY

AN APPROACH TO A NEW COMPREHENSION OF INFECTIONS ASSOCIATED TO CHLAMYDIA AND MYCOPLASMA AND LOW INMUNITY

  Virchow’s idea conceived in 1856 that artherosclerosis could derive from vase inflammation (1) has been reconsidered during the last decades, now from new viewpoints through the use of cellular and molecular biology technics (2). According to this new concept, lipoproteins would exert a fundamental role as they would get into and pile up within the subendothelium space due to an endothelial cell dysfunction. Discovering of metabolic pathway (3) as well as LDL receptors (4) and the oxidation hypothesis of artherosclerosis (5), all contributed to feed the present concept that this is an inflammatory disease.
  Cholesterol particles entering into the vase wall, would get oxided and lead to macrophages activation and inflammation development, increasing oxygen-free cytosines y radicals. Infection agents have been pointed these last years as probable participants in inflammation induction, both for development of atheroma plaques as well as its unstability (6, 7), though with discussable results (8, 9).
  As part of a series of studies performed at the InCor’s Pathology lab, we verified tissue co-infection through Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in atherosclerotic plaques, whose number is related to the inflammation intensity. We have analyzed this aspect both on the stable artherosclerothic plaque and the plaque rupture associated to myocardial infarction, as well as on the initial plaque, characteristic of atherogenesis beginning. We have also studied the flowing serum looking for the detection of possible morphologic differences in elderly patients with and without artherosclerosis that could be connected to the presence of these infectious agents. And also have we studied whether in cardiac transplant´s accelerated atherosclerosis there could exist elevation in the levels of these elements within the vase as important immunosuppression lurks on this therapeutical process. This revision is a summary on a group of studies aiming to certify with anathomic-pathologic data the thesis that infectious agents have active role in human atherogenesis.
   (Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 3:156-63)

Key words
Artherosclerosis - Mycoplasma - Chlamydia

INFLAMACIÓN, REMODELAMIENTO VASCULAR, INESTABILIDAD DE LA PLACA Y PARTICIPACIÓN DE LOS AGENTES INFECCIOSOS EN LA ARTERIOSCLEROSIS CORONARIA
   Estudiamos las arterias coronarias epicárdicas de autopsias de pacientes que fallecieron por infarto agudo del miocardio. Comparamos las placas rotas trombosadas relacionadas con el infarto y que formaron el grupo I, con placas del mismo paciente, con grado semejante de obstrucción pero no rotas y que formaron el grupo II. La placa rota presentó mayor remodelamiento positivo del vaso, mayor volumen, mayor contitución por grasa y capa fibrosa fina y rota (Figura 1a) que la placa estable con el mismo grado de obstrucción (Figura 1b) (10). El remodelamiento positivo del vaso determina una luz mayor, aunque estuviese acompañado de placa voluminosa. Placas inestables estuvieron asociadas a la presencia de mayor inflamación tanto en la placa como en la adventicia (11) (Figura 1c), que fue mayor y estuvo asociada a la destrucción de la membrana elástica externa (Figura 1d). La Chlamydia pneumoniae y las células inflamatorias estuvieron presentes en mayor cantidad en las placas rotas que en las placas estables (Tabla 1) (12).

   Nuestros estudios se diferencian de los demás de la literatura (13-15, 21) por comparar morfológicamente placas rotas con placas estables igualmente obstruidas, analizando aspectos del remodelamiento, cantidad de células inflamatorias y de células positivas para antígeno de C. pneumoniae. Para asegurar la fidedignidad de los datos encontrados, cuatro técnicas fueron utilizadas para la identificación de C. pneumoniae: inmunohistoquímica, microscopia de inmunofluorescencia (Figura 1e), hibridización in situ (para detección del DNA) y microscopia electrónica (Figura 2b y Figura 2c).

   La PCR no fue realizada en nuestro trabajo pues este método ha revelado resultados dispares (de cero hasta 60%) (16-19) y la inmunohistoquímica ha mostrado resultados más constantes. El uso de la PCR real time ha sido recomendado (20-21).
   La microscopia electrónica mostró asociación de C. pneumoniae con otra bacteria, el Mycoplasma pneumoniae, tanto en el intra (Figura 2c) como en el extracelular (Figura 2d). Observamos correlación positiva entre el número de células positivas para C. pneumoniae en la adventicia y el número de linfocitos T y B (Tabla 1), que señala un papel activo de la Chlamydia en la inducción de la inflamación y en el remodelamiento positivo del vaso. El M. pneumoniae se correlacionó con la cantidad de C. pneumoniae, pero no con el número de células inflamatorias.

   Los micoplasmas son los menores microorganismos auto-replicantes que se conocen y necesitan de colesterol para sobrevivir. Tienen como característica inducir infecciones crónicas persistentes, inmunodepresión en el huésped, producción de radicales libres de oxígeno y apoptosis de células. Dependiendo de la célula, los micoplasmas impiden la apoptosis y así pueden favorecer el crecimiento de otros microorganismos (22). De esta forma, la asociación de M. pneumoniae y C. pneumoniae puede estar influyendo en la inmunomodulación del huésped, pudiendo explicar la inflamación crónica inespecífica de la pared del vaso en asociación con la placa arteriosclerótica y su ruptura.
   El análisis de coronarias sin arteriosclerosis mostró la presencia de estos dos agentes en pequeña cantidad en prácticamente 100% de los casos estudiados (12). Por tanto, otros factores ligados a la aterogénesis como colesterol aumentado, estrés, dieta, pueden influenciar en la proliferación de los micoplasmas (23).

LA PARTICIPACIÓN DE LOS AGENTES INFECCIOSOS Y DE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO EN LA ARTERIOSCLEROSIS INICIAL
   El encuentro de grandes cantidades de C. pneumoniae y M. pneumoniae en las placas rotas no significa que estos agentes tengan un papel patogenético en el desencadenamiento de la inflamación. Una hipótesis es que éstos serían contaminantes secundarios de la placa. Hicimos entonces un estudio con placas pequeñas de la aorta, o sea, en el inicio de la aterogénesis.
   Analizamos fragmentos de aorta ascendente retirados durante cirugía de revascularización. Las placas de ateroma en esta región generalmente son poco desarrolladas. Hubo positividad para antígenos de M. pneumoniae y C. pneumoniae en 100% de los casos estudiados. La media, desvío patrón y mediana del porcentaje fueron de: 11.5 + 9.0 y 11.1 para antígenos de M. pneumoniae en la íntima, y 8.1 + 8.2 y 6.2 para C. Pneumoniae, respectivamente. Analizando tanto la normalidad de los casos como el número de macrófagos verificamos que las regiones con más de 4 macrófagos/campo de 400x salían fuera de la distribución normal y los consideramos como focos de acúmulo exagerado de macrófagos, o sea, placas de ateroma iniciales. Estos focos mostraban también acúmulo de células positivas para C. pneumoniae. Considerando todos los fragmentos estudiados, hubo correlación positiva entre el número de células positivas para C. pneumoniae con: número de macrófagos (r=0.51 y p<0.01); de células T CD8 (r=0.6 y p<0.01); T CD4 (r=0.05 y p<0.01) y B CD20 (r=0.6 y p<0.01), en la íntima. No hubo correlación entre M. pneumoniae y número de células inflamatorias, pero hubo correlación entre el número de C. pneumoniae y la cantidad de M. pneumoniae (24). Las células CD8 fueron las células inflamatorias presentes en mayor número tanto en las lesiones precoces como en las complicadas25. Los factores de crecimento no mostraron correlación con mayor espesamiento intimal, ni con mayor cantidad de agentes infecciosos o inflamación. Se sabe que placas de ateroma bien desarrolladas o complicadas son ricas en factores de crecimento. La falta de factores de crecimento en las placas de la aorta ascendente puede explicar la tendencia local de que no haya un desarrollo más acentuado de las placas de ateroma.
   Conclusión: La demostración de la presencia de C. pneumoniae y M. pneumoniae en las lesiones arterioscleróticas iniciales y la correlación de estos agentes entre sí y con la intensidad de la inflamación es un fuerte argumento a favor de una interacción entre estos dos agentes y su participación en la aterogénesis.

PARTÍCULAS DE LIPOPROTEÍNAS DE M.PNEUMONIAE, C.PNEUMONIAE, PROTEÍNA C REACTIVA EN EL SUERO DE PACIENTES DE EDAD AVANZADA ARTERIOSCLERÓTICOS
   La arteriosclerosis es la principal enfermedad que ocurre con la edad. Estudios epidemiológicos que analizaron tradicionales factores de riesgo para enfermedades cardiovasculares tales como: niveles lipídicos, diabetes, factores genéticos asociados a enfermedad coronariana, hipertensión o insuficiencia cardíaca congestiva han concluido que el mayor factor de riesgo para arteriosclerosis es la edad avanzada (25). Los mecanismos involucrados en este proceso no están bien esclarecidos, pero la edad contribuye para un tiempo mayor de exposición a otros factores de riesgo dependientes del tiempo.
   Los marcadores inflamatorios usualmente presentes en infecciones están generalmente aumentados conforme avanza la edad. Uno de los ejemplos más estudiados en los últimos años es la proteína C reactiva, uno de los principales marcadores inflamatorios de arteriosclerosis activa y que se muestra aumentado con la edad, la obesidad y en pacientes con perfil lipídico aterogénico, además de otras enfermedades como episodios de enfermedad vascular aguda (infarto agudo del miocardio y ACV) y artritis (26-28). La proteína C reactiva (PCR) parece no estar relacionada con enfermedad activa (29), no obstante puede revelar infección crónica subclínica. La PCR tiene una forma típica pentamérica en disco y puede ser vista al microscopio electrónico (30).
   Por los datos descritos anteriormente, agentes infecciosos como C. pneumoniae y M. pneumoniae pueden estar desempeñando un papel en el desarrollo de la arteriosclerosis. Los micoplasmas son capaces de sintetizar lipoproteínas, las cuales tienen capacidad de activar macrófagos (31). Tal activación es seguida de un aumento en la producción de TNF alpha, IL-1 y GM-CSF por los macrófagos (32), factores éstos que también están presentes en la arterioesclerosis como consecuencia de la activación de los macrófagos (33).
   Así, sostenemos la hipótesis de que lipoproteínas producidas por M. pneumoniae pueden estar participando activamente en el desarrollo de la arteriosclerosis humana. Se considera que títulos de anticuerpos contra M. pneumoniae relativamente más bajos que los habituales ya deben ser considerados como infección activa en pacientes de edad avanzada. Buscamos analizar si lipoproteínas de M. pneumoniae y partículas de PCR son reconocibles en el suero de pacientes de edad avanzada por la inmunomicroscopia electrónica y si están en cantidades más elevadas en los arterioescleróticos.
   Dos grupos de pacientes con más de 65 años de edad (12 individuos sanos y 13 arterioscleróticos) fueron analizados respecto de las características en el suero: nivel bioquímico de PCR, colesterol y triglicéridos. Una muestra de 1.0 ml del mismo suero fue estudiada en microscopia electrónica para detectar la presencia de estructuras compatibles con lipoproteínas de MP y PCR. Formas redondeadas lipídicas marcadas con anticuerpo anti antígeno de M. pneumoniae fueron observadas en el suero de ambos grupos de pacientes, y consideradas como lipoproteínas de MP (Figura 2d). El número de partículas de PCR y de MP por mm2 de foto ampliada 5x fue mayor en el grupo arteriosclerótico (Figura 2) que en el normal y mostraron correlación entre sí. Cuando se analizó por doble marcación (oro-coloidal de 10nm anti-MP y de 5 nm anti-PCR) se encontraron agregados lipídicos de MP y PCR (Figura 2e).
   La especificidad de los datos encontrados fue confirmada a través del estudio de otros materiales:
   a) gel de electroforesis de proteínas de pacientes con nivel elevado de CRP;
   b) banda beta del gel de electroforesis de lípidos en donde se acumulan las LDL; y
   c) cultivo puro de M. pneumoniae.
   El cultivo de micoplasmas mostró positividad contra antígeno de superficie, generalmente en polos del microorganismo, tal vez representando la organela de adhesión. También estructuras electrón densas pequeñas, homogéneas, sueltas, posiblemente lipoproteínas de micoplasma, marcaron con el anticuerpo ligado al oro. Estos resultados indican que las reacciones obtenidas en los sueros son respectivamente específicas para PCR y para productos antigénicos de los micoplasmas.
   En conclusión, los datos morfológicos de los trabajos desarrollados hasta el presente momento son favorables a la tesis de que la arteriosclerosis es una reacción del vaso a la injuria, con inflamación de la pared. M. pneumoniae y C. pneumoniae están presentes tanto en la arteriosclerosis complicada que lleva al infarto agudo del miocardio, como en la arteriosclerosis inicial. Otros factores como shear stress, cigarrillo, colesterol, hipertensión, etc., pueden tener participación hasta en el favorecimiento de la proliferación de estos agentes infecciosos. Los micoplasmas pueden producir partículas de lipoproteínas y estimular la produción de PCR.

LA CHLAMYDIA PNEUMONIAE Y LA ARTERIOSCLEROSIS ACELERADA POSTRASPLANTE CARDÍACO
   En trabajo previo mostramos que la arteriosclerosis acelerada de las coronarias epicárdicas en el trasplante está con frecuencia asociada a la vasculitis linfocitaria del vasa vasorum (Figura 3a) y a la vasculitis intramiocárdica (Figura 3b), la cual a su vez se asocia a lesiones isquémicas del miocardio, en las autopsias de pacientes trasplantados cardíacos (35). En el presente estudio investigamos si la C. pneumoniae puede estar relacionada con esta vasculitis del trasplante. Un segmento representativo proximal y uno distal de las arterias epicárdicas de 35 necropsias de pacientes trasplantados cardíacos fueron analizados. Los casos fueron agrupados conforme el tiempo de sobrevida del trasplante: G0 (n=6): <3 días de trasplante; GI (n=12): 3 a 160 días de sobrevida postrasplante y GII (n=17): >160 días de sobrevida. Antígeno de CP fue detectado por inmunohistoquímica. Áreas: total e intimal de secciones transversales fueron obtenidas de análisis de imágenes Leica, Quantimet 500. Se contó el número medio de células positivas para C. pneumoniae/campo de 400x. Se realizó análisis semicuantitativo de la intensidad de la inflamación en la adventicia: 0=cero (ausente), + = leve (con raros focos), ++ = moderada (con numerosos focos) y +++ = intensa (inflamación difusa). El test de Kruskal Wallis y el test de correlación de Pearson o Spearman fueron usados, conforme se presentan resultados con distribución normal o no. Hubo cantidad significativamente mayor de CP en el grupo I (14.08 + 8.92) y en el grupo II (10.01 + 7.60) que en el grupo 0 (1.36 + 0.37) (p<0.01). En el grupo II, hubo correlación positiva entre espesamiento intimal con área total del vaso (r=0.84; p<0.001) y con el tiempo de sobrevida del trasplante (r= 0.50; p<0.05); entre número de CP e intensidad de la inflamación (r=0.57; p<0.05) y espesamiento intimal (r=0.48; p=0.05).
   En conclusión, los donantes de corazón presentan con frecuencia C. pneumoniae en la adventicia de las arterias coronarias. La arteriosclerosis acelerada del trasplante se correlaciona con el aumento de antígenos de C. pneumoniae y con inflamación en la adventicia, sugeriendo que la proliferación de C. pneumoniae preexistente pueda tener un papel importante en la patogénesis de esta complicación grave del trasplante cardíaco.
   El análisis de una biopsia endomiocárdica de paciente trasplantado cardíaco y que presentó vasculitis intramiocárdica mostró intensa positividad para antígeno de C. pneumoniae (Figura 3c), como presencia de depósitos de inmunoglobulinas (Figura 3d) y complemento. Estamos iniciando un trabajo retrospectivo de pacientes que desarrollaron arteriopatía del trasplante para evaluar si hay correlación entre esta vasculitis, la presencia de C. pneumoniae y el desarrollo de esta arteriopatía.
   Trabajos futuros en esta área son necesarios para que eventualmente se puedan proponer cambios terapéuticos tales como el uso de antibióticos.

CONSIDERACIONES FINALES

  Esta serie de trabajos apuntan a la participación de dos agentes infecciosos: C. pneumoniae y M. pneumoniae en la patogénesis de la arteriosclerosis. En la patogénesis de la arteriosclerosis acelerada del trasplante verificamos solamente involucramiento de C. pneumoniae. El M. pneumoniae parece tener papel en la inmunodepresión del sistema inmunológico del huésped y favorece la proliferación de clamidia. Cuando estos datos se confirmen verdaderos estaremos frente a una nueva interpretación patogenética de las enfermedades consideradas usualmente como degenerativas, lo que debe llevar a nuevas propuestas terapéuticas. La dificultad de erradicar tanto los micoplasmas como las clamidias con los antibióticos actualmente existentes torna difícil la interpretación de los resultados de trabajos de prevención de infarto y otras complicaciones basados en terapéutica con antibióticos. Hay que buscar nuevos modelos de tratamiento antimicoplasmas.

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