REVISTA ARGENTINA DE CIRUGÍA CARDIOVASCULAR
Vol. II - N° 2 / Junio - Julio - Agosto 2004

ARTÍCULO ORIGINAL
ANGIOGÉNESIS TERAPÉUTICA

RESUMEN

   El término angiogénesis fue utilizado por primera vez en 1787 por el cirujano británico Mr. Hunter, pero realmente fue acuñado en el año 1935 para describir la formación de neovasos en la placenta. En 1963 se aceptó la hipótesis de que los tumores sólidos eran angiogénesis-dependientes y en 1968 dos experimentos demostraron que las células tumorales producían factores angiogénicos solubles. Tres años después se aisló el primer factor angiogénico. Posteriormente numerosos estudios in vitro e in vivo han facilitado el conocimiento más amplio de los mecanismos de neovascularización.
   El desarrollo de nuevos tratamientos encaminados a aumentar el aporte sanguíneo del corazón isquémico continúa siendo un reto para los investigadores en el campo cardiovascular. Inicialmente, la RTML, por medio de un proceso inflamatorio, conseguía estimular la síntesis de neovasos. Posteriormente, la aplicación de factores de crecimiento, de forma más directa, lograba el objetivo de aumentar la densidad vascular. La aplicación de la terapia génica nos ha permitido mantener la síntesis endógena de un factor de crecimiento durante un periodo de tiempo, lo que se ha trasladado en excelentes respuestas angiogénicas en los territorios tratados, tanto es así que en algún caso llegaron a formarse angiomas, lo que nos obliga a ser cautos, especialmente con vectores que originan transfecciones duraderas. Por último, el transplante celular nos ha permitido implantar directamente las células que formaran los nuevos vasos en el territorio isquémico, lo cual a priori, es muy alentador. En la actualidad, parece que el futuro pueda estar en desarrollar sustancias (como el factor 1 derivado de las células estromales) que ayuden a generar mayor número de estas células madre por el propio organismo y facilitar que encuentren su camino hasta el miocardio isquémico o necrótico. De cualquier forma, como dice la canción, y parafrasea el editor de Circulation, James T. Willerson, en un reciente artículo “the future's so bright, [we've] gotta wear shades!” (¡el futuro es tan brillante, que deberíamos llevar gafas de sol!).
   (Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 2:105-115)

Palabras clave
Angiogénesis - Regeneración cardíaca - Células madre

RESUMO

ANGIOGÊNESE TERAPÊUTICA

   O termo angiogênese foi utilizado pela primeira vez em 1787 pelo cirurgião britânico Mr. Hunter, porém realmente foi aplicado em 1935 para descrever a formação de neovasos na placenta. Em 1963 foi aceita a hipótese dos tumores sólidos serem angiogênese-dependentes e em 1968 dois experimentos demonstraram que as células tumorais produziam fatores angiogênicos solúveis. Três anos depois, isolou-se o primeiro fator angiogênico. Posteriormente numerosos estudos in vitro e in vivo tem facilitado o conhecimento mais amplo dos mecanismos de neovascularização.
   O desenvolvimento de novos tratamentos encaminhados a aumentar o aporte sangüíneo do coração isquêmico continua sendo um desafio para os investigadores no campo cardiovascular. No início, a RTML, por meio de um processo inflamatório conseguia estimular a síntese de neovasos. Posteriormente, a aplicação de fatores de crecimento, de forma mais direta, lograva o objetivo de aumentar la densidade vascular. A aplicação da terapia gênica, tem nos permitido manter a síntese endógena de um fator de crescimento durante un período de tempo, o que significou excelentes respostas angiogênicas nos territórios tratados, de tal maneira que em algum caso chegaram a se formar angiomas, fato que nos obriga a ser cautelosos, especialmente com vetores que originam transfecções duradouras. Por último, o transplante celular tem nos permitido implantar diretamente as células que formarão os novos vasos no território isquêmico, o que, a priori, é muito alentador. Na atualidade, parece que o futuro possa estar no desenvolvimento de substâncias (como o fator 1 derivado das células estromais) que ajudem a gerar maior número destas células-mãe pelo próprio organismo e facilitar que encontrem seu caminho até o miocárdio isquêmico ou necrótico. De qualquer forma, como diz a música, e parafraseia o editor de Circulation, James T. Willerson, num recente artículo: “the future's so bright, [we've] gotta wear shades!” (o futuro é tão brilhante, que deveriamos levar óculos escuros!).
   (Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 2:105-115) .

Palavras chave
Angiogênese - Regeneração cardíaca - Células-mãe

SUMMARY

THERAPEUTICAL ANGIOGENESIS

  The word angiogenesis was used for the first time in 1787 by Mr. Hunter, a british surgeon, but it was actually coined in 1935 in order to describe formation of new vessel within the placenta. During 1963 the working thesis that solid tumors were angiogenesis-depending was accepted and in 1968 two experiments demostrated that tumoral cells produced soluble angiogenic factors. Three years later, the first angiogenic factor was isolated. Thereafter, many in vitro and in vivo studies have helped to spread a wider knowledge of neovascularization mechanisms.
   The development of new treatments driven to increase the blood flow of the ischemic heart keeps on being a challenge for researchers in the cardiovascular field. Initially, the RTML, through an inflammatory process could stimulate the synthesis of new vessel. Later on, the direct application of growing factors reached the goal of increasing the vascular density. Application of genes therapy has allowed maintaining the endogenous synthesis of a growing factor during a period of time. This has evolved to excellent angiogenic feedbacks on treated territories, up to a point that led to some cases of angioma formation, thus obliging us to act with caution, specially with vectors originating lasting transfections.
   Eventually, celular trasplant has permitted the direct implanting of cells that will constitute the new vases within the ischemic territory, which is very encouraging at an early stage. Nowadays it looks promising the development of substances (like factor 1 derived from stromal cells) helping the organism itself to generate a higher number of these mother cells and leading them to find their way up to the ischemic or necrotic miocardium. Any way, as heard in the lyrics of the song paraphrased by James T. Willerson, Circulation´s editor, in a recent article: “the future's so bright, [we've] gotta wear shades!”
   (Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 2:105-115) .

Key words
Angiogenesis - Cardiac regeneration - Stem cells

INTRODUCCIÓN

   En las últimas décadas, gracias a grandes avances en el tratamiento de la cardiopatía isquémica, hemos asistido a una reducción en la tasa de mortalidad de las enfermedades cardiovasculares. No obstante, al mejorar el pronóstico y alargar la vida se ha prolongado la evolución de la enfermedad y se ha dado pie a la aparición de una nueva forma de angina: la angina refractaria. Se trata de una angina severa, tanto de reposo como de mínimos esfuerzos, que se manifiesta en pacientes con el máximo tratamiento farmacológico y sin la posibilidad técnica de realizarles un procedimiento convencional de revascularización coronaria. Suele aparecer tras una larga evolución de la enfermedad coronaria, y su diagnóstico exige descartar cualquier posible tratamiento (1).
   En los últimos años se han desarrollado nuevas terapias para la angina refractaria, encaminadas a aumentar el aporte de sangre en los territorios isquémicos mediante la formación de nuevos vasos, “angiogénesis terapeútica”.
   El término angiogénesis fue utilizado por primera vez en 1787 por el cirujano británico Mr. Hunter, pero realmente fue acuñado en el año 1935 para describir la formación de neovasos en la placenta (2). En 1963 se aceptó la hipótesis de que los tumores sólidos eran angiogénesis-dependientes (3). y en 1968 dos experimentos (4-5). demostraron que las células tumorales producían factores angiogénicos solubles. Tres años después se aisló el primer factor angiogénico. Posteriormente numerosos estudios in vitro e in vivo han facilitado el conocimiento más amplio de los mecanismos de neovascularización.


FISIOLOGÍA DEL DESARROLLO VASCULAR

   En el desarrollo y formación de nuevos vasos se diferencian tres etapas: vasculogénesis, angiogénesis y arteriogénesis (Tabla 1). En cada una de estas tres etapas actúan un gran número de factores de crecimiento que dirigen y modulan este proceso (Tabla 2).

  La vasculogénesis consiste en la formación de vasos rudimentarios a partir de angioblastos o células precursoras pluripotenciales angioblásticas. Estos angioblastos forman inicialmente los islotes sanguíneos, y de estos, las células de la periferia se diferencian en precursores endoteliales, mientras que las que quedan en el centro lo hacen hacia precursores hematopoyéticos. Inicialmente se pensaba que la vasculogénesis sólo tenía lugar en la etapa embrionaria, pero recientemente se han aislado precursores pluripotenciales angioblásticos en etapas postembrionarias, siendo su origen la médula ósea. Las circunstancias que en la edad adulta hacen a estas células migrar a un punto concreto y comenzar la formación de nuevos vasos in situ permanecen en estudio, aunque se conoce que el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y el factor estimulador de colonias de granulocitos-monocitos (GM-CSF) están implicados. Una vez que los angioblastos llegan al lugar adecuado, parece que el VEGF, su receptor (VEGFR2) y el factor de crecimiento de fibroblastos-básico (FGFb) son los encargados de estimular su diferenciación hacia células endoteliales (6).
   Una etapa posterior es la angiogénesis, que es el mecanismo más frecuente de desarrollo neovascular en el corazón humano y consiste en la formación de nuevos vasos con células periendoteliales, y en ausencia de túnica media. Puede darse tanto en la etapa embrionaria como en la edad adulta.
   La angiogénesis consta de distintas etapas que tienen lugar a partir de los vasos surgidos mediante vasculogénesis. Inicialmente estos vasos se dilatan por efecto del óxido nítrico (mediado por VEGF), y aumentan su permeabilidad, lo que permite la extravasación de proteínas plasmáticas y la degradación de matriz extracelular por las metaloproteinasas (MMPs), creándose un espacio para nuevas migraciones de células endoteliales, que a su llegada secretarán más FGFb, VEGF, y factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), con lo que se origina un feed-back positivo, induciendo la proliferación y migración de nuevas células endoteliales, que se ordenan formando cordones sólidos y posteriormente se tunelizan, aumentan su diámetro (mediado fundamentalmente por VEGF 121 y 165) (6) y se ramifican. Por último, las células periendoteliales sintetizan péptidos vasoactivos, factores de crecimiento, citokinas y la matriz extracelular, que sirve de estructura de soporte, a través de la cual los vasos migran y almacenan y movilizan factores de crecimiento. La llegada de estas células periendoteliales está mediada por el PDGF-BB, cuya síntesis y liberación es estimulada por VEGF.
   La arteriogénesis consiste en el desarrollo y crecimiento de los pequeños vasos preexistentes (originados mediante angiogénesis) formando verdaderas arterias con túnica media (músculo liso), capaces de soportar una adecuada circulación sanguínea y adaptarse a las oscilaciones fisiológicas de demanda. Se inicia por una situación de isquemia, que hace que las células endoteliales expresen citoquinas (MCP-1) y moléculas de adhesión (ICAM-1), lo que conlleva un reclutamiento de monocitos y posterior infiltración y proteolisis de la pared vascular. Además intervienen bFGF, PDGF-B y TGF-1, sintetizadas también por las células endoteliales (7).

Estímulos fisiológicos de la angiogénesis
   Los principales factores fisiológicos relacionados con el desarrollo de circulación colateral son la isquemia y los factores mecánicos.
   La angiogénesis es una respuesta fisiológica al estrés hipóxico in vivo, pero no están claros los mecanismos y estímulos concretos que inician el desarrollo de colaterales en respuesta a la isquemia tisular. Fleisch demostró en pacientes con enfermedad coronaria estable la asociación que existía entre FGF-2, VEGF y la circulación colateral, siendo esta relación menor para el FGF-2 que para el VEGF. Según parece, la isquemia aumenta el VEGF, y éste y la propia isquemia aumentan el receptor KDR de VEGF. El aumento de VEGF en respuesta a la hipoxia es un mecanismo fisiológico de feed-back, que es mediado por el factor inducible por la hipoxia (HIF). En situación normal, la subunidad a del HIF-1 es degradada, pero durante la hipoxia, esta degradación se reduce, con lo que aumentan sus niveles y a su vez la expresión del gen promotor del VEGF (8). También en la fase inicial de la dilatación de las colaterales, factores mecánicos como el estrés tangencial en la pared vascular pueden iniciar un remodelado vascular y estimular el crecimiento de células musculares lisas vasculares a través del receptor de factor de crecimiento epidérmico.


ANGIOGÉNESIS TERAPEÚTICA

   Para el estímulo de la angiogénesis en pacientes con isquemia refractaria se han aplicado múltiples técnicas: revascularización transmiocárdica con láser, revascularización “mecánica”, aplicación de factores de crecimiento, terapia génica y trasplante de células madre.

Revascularización transmiocárdica con láser (RTML)
   Basándose en la anatomía del corazón de los reptiles (arterias epicárdicas junto a múltiples sinusoides intramiocárdicos que aportan el flujo sanguíneo al ventrículo), Mirhoseini (9) decidió aplicar por primera vez la energía láser para la creación de canales miocárdicos que mejoraran la perfusión miocárdica (inicialmente acompañando a injertos aorto-coronarios en pacientes no revascularizables totalmente). Posteriormente, 4 estudios randomizados en pacientes con angina refractaria demostraron la mejoría clínica conseguida en estos pacientes mediante RTML.
   El mecanismo de acción de esta técnica ha permanecido en discusión, aunque parece que la estimulación de un neocrecimiento vascular es la causa más probable responsable de la mejoría clínica (10). Distintos autores demostraron una proliferación de nuevos vasos en las zonas tratadas así como en su periferia. Posteriormente, intentando explicar el mecanismo de este sobrecrecimiento vascular, Horvath demostró que la RTML origina un estímulo para la expresión del gen de VEGF y un aumento de sus niveles en tejido. Nuestro grupo, en un modelo porcino de isquemia miocárdica crónica también observó una mayor densidad vascular en la zona tratada con láser al compararla con la zona no tratada de esos mismos corazones y frente a animales controles. Además esta mayor densidad vascular se correlacionaba con un aumento en los niveles de VEGF a nivel de seno coronario en los animales tratados.
   Respecto a los posibles mediadores de este proceso neoangiogénico, parece que además del VEGF que ya hemos comentado, pueden intervenir metaloproteinasas de matriz, el factor de crecimiento endotelial derivado de las plaquetas según describió Li, la procalcitonina y distintas células como los neutrófilos (11).

Revascularización mecánica
   El crecimiento vascular observado en numerosos estudios experimentales con RTML, también se ha documentado al realizar canales miocárdicos con otros medios. Inicialmente, en 1996, Whittaker (12) comparó en ratas el efecto protector frente a la oclusión de una arteria coronaria de canales realizados con láser frente a los realizados con agujas. En este estudio, el tamaño del infarto fue menor en los grupos de tratamiento (láser o agujas) que en los controles. No demostró un aumento en la densidad vascular en la zona tratada, pero sirvió de punto de partida hacia la idea de que probablemente el láser no era lo más importante de este tratamiento, sino la injuria miocárdica y el posterior proceso inflamatorio.
   Más tarde distintos estudios han mostrado bien un aumento en el crecimiento de nuevos vasos o bien de factores de crecimiento vascular tras realizar canales miocárdicos con agujas, con taladros eléctricos o con radiofrecuencia (13) siendo la densidad de neovasos similar, independientemente del método utilizado para hacer los canales.
   Según se desprende de un estudio de Chu, que comparó la RTML con la revascularización mecánica mediante canales realizados con agujas, la respuesta neoangiogénica depende más bien del grado de inflamación que del mecanismo empleado para hacer el canal, ya que el grupo con mayor crecimiento vascular y mayores niveles de VEGF fue aquél en el que se hicieron más canales.
   Tras analizar tanto los resultados de la angiogénesis inducida por RTML o por otros métodos que podemos llamar “mecánicos”, el crecimiento de nuevos vasos no parece depender en exclusiva de la energía láser sino más bien de una respuesta inespecífica propia de fenómenos inflamatorios, que a través de la mediación de citokinas y factores de crecimiento en el seno de un tejido de granulación originan un crecimiento vascular aumentado, motivo que ayudaría a paliar la isquemia de los pacientes tratados.
 
Angiogénesis terapeútica utilizando factores de crecimiento
   Los factores de crecimiento son polipéptidos que inducen la proliferación de células endoteliales y musculares lisas vasculares. No poseen características estructurales comunes, sino que se agrupan en familias diferentes que comparten la propiedad de ejercer su acción inductora in vivo e in vitro a bajas concentraciones (10-9-10-11M). Estos factores se diferencian de los factores endocrinos clásicos (hormonas) en que son sintetizados por múltiples tipos celulares y tejidos, no en glándulas especializadas, y en que su acción es local, autocrina o paracrina.
   El proceso de estimulación celular por parte del factor de crecimiento comienza con la unión de éstos a sus receptores, iniciando una cascada de señales que llega al núcleo celular y modula la función de enzimas y proteínas estructurales. La mayor parte de los factores de crecimiento son reguladores positivos del ciclo celular, estimulando la proliferación y migración e inhibiendo la apoptosis (Tabla 3).
   Como ya hemos visto, existen múltiples factores de crecimiento vascular, pero inicialmente los que más se han utilizado para la angiogénesis terapeútica son el FGF y el VEGF. Ambos factores de crecimiento se han estudiado como tratamiento en modelos de isquemia miocárdica, utilizando diferentes vías de administración (intracoronaria, intramiocárdica, intrapericárdica, intravenosa o sistémica).

Tratamiento con FGF
   El primer autor que investigó la acción del FGF-2 exógeno sobre la angiogénesis fue Yanagisawa en 1992, al observar que en inyección intracoronaria disminuía el tamaño del infarto, mejoraba la función sistólica y aumentaba el número de capilares. Posteriormente Battler, Lazarous, Landau, Uchida, Watanabe y otros, con diferentes modelos experimentales de isquemia crónica, aguda o infarto y diferentes técnicas de administración observaron que el FGF producía mejoría de la perfusión y función miocárdicas secundarias a un incremento de la densidad neovascular (14).
   En cuanto a su aplicación clínica, el primero de estos estudios fue el publicado por Schumacher, en 20 pacientes con enfermedad coronaria difusa, a quienes se les realizó cirugía de revascularización coronaria, y se inyectó FGF-1 a nivel intramiocárdico próximo a las anastomosis realizadas. Como control se utilizó un grupo similar de pacientes sin inyección de dicho factor. En el seguimiento al año de dichos pacientes se objetivó por angiografía un aumento de la formación de nuevos vasos próximos a la zona de inyección del factor de crecimiento, no observándose dicho efecto en el grupo control. No obstante no mejoró la función ventricular ni la perfusión miocárdica.
   El grupo de trabajo en angiogénesis del Beth Israel (Boston, USA) publicó un estudio preliminar con resultados esperanzadores. En un grupo de ocho pacientes con enfermedad multivaso y algún territorio no revascularizable, se les realizó un puente aorto-coronario a aquellas arterias de buen calibre, y se administró en la grasa epicárdica de los territorios no revascularizables y alrededor de los puentes, cápsulas de liberación sostenida que contenían entre 1 y 10 µg de FGF-b. Observó una mejoría clara en la perfusión miocárdica con técnicas isotópicas en tres de los ocho pacientes, mientras que en otros tres la mejoría fue menos evidente (todo esto en los territorios no susceptibles de pontaje, en los que se inyectó FGF-b). Los ocho pacientes permanecieron libres de angina a los tres meses. No se observó toxicidad renal, ni hematológica, ni hepática en ningún paciente. Un año después publicaron una serie más extensa con 24 pacientes randomizados a 10, 100 µg de FGF-2 o placebo. Se les realizaron estudios de perfusión y RNM basales y a los 90 días. Fallecieron dos pacientes durante la cirugía. A los 90 días todos los pacientes del grupo de mayor dosis permanecían sin angina, mientras que tres de los controles continuaban sintomáticos. Además los defectos de perfusión mejoraron claramente, mientras que no fue así en el grupo de dosis baja ni en los controles.
   Más recientemente, Udelson utilizó FGF 2 por vía intracoronaria (en 45 pacientes) e intravenosa (en 14 pacientes) con isquemia reversible y no tratable con los procedimientos habituales. Observaron una mejoría evidente en la perfusión miocárdica determinada con SPECT, que se mantenía 180 días tras el procedimiento.
   El mayor estudio fase II con FGF es el FIRST trial. Compara tres dosis (0,3-3-30 µg/kg de FGF 2) por vía intracoronaria vs. placebo en 337 pacientes. A los 90 días no se apreciaba mejoría significativa en la prueba de esfuerzo ni en los estudios de perfusión con estrés. En cambio, eran significativas las mejoras en el grado de angina y el tamaño de los defectos de perfusión basal (sin estrés) de los pacientes tratados. En un subestudio, que tenía en cuenta únicamente a los pacientes más sintomáticos y con mayor isquemia, todos los parámetros mejoraron de forma significativa.

Tratamiento con VEGF
   El VEGF, o factor de permeabilidad vascular (VPF), es un factor específico del endotelio que interviene tanto en la angiogénesis adaptativa como en la patológica. Fue descubierto a comienzos de los ‘80 por Dvorak como un factor que aumentaba la permeabilidad vascular. Años después se demostró que estimulaba la migración y replicación de las células endoteliales, siendo un factor angiogénico in vivo.
   En varios modelos animales de isquemia miocárdica aguda y crónica se ha observado que la administración de VEGF produce un incremento del número de neovasos, aumento de la perfusión tisular y mejoría de la función ventricular. En cuanto a la forma de aplicar el VEGF, es más eficaz la infusión intracoronaria o inyección intramiocárdica que la infusión sistémica intravenosa.
  En cuanto a su aplicación clínica, destaca el estudio VIVA, randomizado, controlado y doble ciego, fase II, en 178 pacientes sin opción de revascularización convencional, a los que se les administraban 2 dosis diferentes de VEGF, primero una por vía intracoronaria, seguidas de tres dosis intravenosas en la siguiente semana. Este estudio resultó negativo en cuanto al tiempo de ejercicio, mejoría clínica o imágenes de perfusión a los 60 días de seguimiento. A los 120 días, existían diferencias significativas en cuanto al grado anginoso en el grupo de mayor dosis respecto al control y grupo de dosis menor. No obstante, este estudio ha sido muy criticado por el modo de administración de la proteína (primero intracoronario y posteriormente tres dosis intravenosas) y por el alto número de pacientes en clase II randomizados.

Otros factores de crecimiento vascular
   El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es una molécula producida por megacariocitos y plaquetas que se libera durante el proceso de coagulación y actúa a través de receptores de tipo tirosina-quinasa induciendo angiogénesis. Se localiza también en placenta, macrófagos, células musculares lisas, células del sistema nervioso central, endotelio y varios tipos tumorales. El PDGF-BB ha mostrado su efecto estimulador de la angiogénesis a nivel experimental, que parece estar mediado por un aumento en la síntesis endógena de VEGF.
   El factor plasmático XIII estabiliza los trombos de fibrina en los estadios finales de la coagulación y participa en los procesos de cicatrización. Recientemente, Dardik demostró que además ejerce una acción proangiogénica, estimulando proliferación y migración de células endoteliales e inhibición de la apoptosis.
   Otro mediador que recientemente se ha utilizado para estimular la angiogénesis es el TWEAK, miembro de la superfamilia del factor de necrosis tumoral. El TWEAK ejerce acciones proangiogénicas directas, estimula el crecimiento y migración de células endoteliales e indirectas, incrementa la actividad mitótica del FGF-2 y VEGF-A.

Angiogénesis terapeútica mediante terapia génica
   La terapia génica asociada a factores de crecimiento consiste en introducir la cadena genética de un factor de crecimiento angiogénico (VEGF, FGF, HGF...) a una determinada célula utilizando un “vector” (virus o plásmidos) para que esta célula inicie la síntesis de esta proteína (15).

Vectores utilizados en angiogénesis terapeútica y modo de aplicación
   En angiogénesis terapeútica cardiovascular, un alto porcentaje de trabajos publicados han utilizado vectores no virales (liposomas o plásmidos de DNA), lo cual contrasta con la dominancia de los vectores víricos (adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus y lentivirus) que se han utilizado en patologías no cardíacas (15). En general, los vectores virales producen transfecciones más estables, que duran aproximadamente 2-3 semanas. No obstante, la efectividad alcanzada con vectores no virales en angiogénesis terapeútica puede ser explicada por el hecho que estamos intentando aumentar la síntesis de una molécula que al menos parte de las células diana (células endoteliales), se sintetizan de forma natural y con la condición de células multinucleadas de las células musculares lisas, con lo que la transfección génica tiene varios destinos por célula transfectada (15). Existen varias vías para administrar los vectores: punciones intramiocárdicas, ya sean mediante toracotomía o con catéter percutáneo, intracoronaria y pericárdica. La más utilizada y con buenos resultados ha sido mediante punción intramiocárdica (16-17) incluso sin necesidad de toracotomía, utilizando técnicas percutáneas mediante inyección a través de catéteres dotados de una aguja. También ha resultado eficaz la aplicación intracoronaria de un adenovirus expresante de FGF-5 y a nivel clínico de un adenovirus expresante de VEGF-165. No obstante, al comparar la vía intracoronaria frente a la inyección intramiocárdica para aplicar un adenovirus expresante de VEGF121, Lee observó mejores resultados en cuanto a la distribución del adenovirus, niveles tisulares de VEGF121, e índice de colaterales determinado por angiografía con la inyección intramiocárdica. La aplicación de un adenovirus codificador de VEGF165 en el pericardio de un modelo canino no incrementó el flujo colateral.

Terapia génica con FGF
   En terapia génica, el uso del FGF ha sido minoritario. Inicialmente, Giordano en un modelo porcino de isquemia crónica consiguió con terapia génica mediada por adenovirus expresante de FGF5, y administrado por vía coronaria, un aumento significativo en el número de neovasos en todo el miocardio (tanto isquémico como no). En cuanto a su aplicación clínica, destaca un estudio randomizado, AGENT, realizado con un adenovirus expresante de FGF-4, y administrado por vía intracoronaria, que ha demostrado recientemente la seguridad (ausencia de angiomas, miocarditis, retinopatías o neovascularización corneal) de esta forma de administración así como su eficacia en disminuir la angina y mejorar la tolerancia al esfuerzo físico en aquellos pacientes que antes del tratamiento estaban en peor grado funcional (aquellos en que antes del tratamiento el tiempo de ejercicio era menor de 10 min.). En el resto de pacientes no se observaron diferencias significativas en el grado anginoso ni en la tolerancia al esfuerzo.

Terapia génica con VEGF
   Diversos estudios experimentales han mostrado la eficacia angiogénica de las distintas isoformas del VEGF. Nosotros, utilizando un adenovirus expresante de VEGF-165 en un modelo porcino de isquemia miocárdica crónica, objetivamos una densidad vascular 6 veces mayor en los territorios tratados frente a los controles (18).    El primer trabajo clínico que utilizó la angiogénesis terapeútica mediante terapia génica en el campo cardiovascular es el firmado por Baumgartner en el que aplicó a nivel intramuscular un plásmido codificador de VEGF a pacientes con enfermedad vascular periférica e indicación de amputación. Observaron un aumento en los niveles plasmáticos de VEGF, una mejoría clínica (en las úlceras isquémicas y en la necesidad de amputación) y un mayor desarrollo de vasos colaterales por angiografía. El uso de esta técnica a nivel miocárdico como tratamiento de la angina refractaria fue posterior. Losordo aplicó mediante inyección intramiocárdica un plásmido de DNA codificador de VEGF165, en el territorio isquémico de cinco pacientes, en los que se observó una disminución del grado anginoso. La fracción de eyección mejoró en dos (permaneciendo igual en los otros tres). En cuanto a la perfusión miocárdica, se determinó con SPECT, mostrando en todos ellos una disminución de la isquemia. Un año después, publicaron una nueva serie clínica con 20 pacientes, con resultados similares. También objetivaron una mejoría en la perfusión, y en el seguimiento a 180 días, el 70% de los pacientes permanecían sin angina. Un segundo estudio fase I utilizó un adenovirus E1-E3- expresante de VEGF121 en 21 pacientes, de los cuales a 15 se les realizó conjuntamente injerto aorto-coronario, y a 6 la inyección del Adv. VEGF121 de modo aislado. No se apreciaron efectos tóxicos por el adenovirus. En cuanto a los resultados, se destacó una mejoría en el grado anginoso de todos los pacientes. Además, en la mayoría de los enfermos tratados, los estudios angiográficos demostraron un incremento del número de colaterales en los territorios donde se aplicó el VEGF. De forma aislada, en 4/6 pacientes del grupo sin bypass se observó una mejoría de la perfusión con Tc-sestamibi en las zonas tratadas. Recientemente se ha publicado el seguimiento al año de pacientes con angina refractaria que fueron tratados mediante toracotomía e inyección miocárdica de un plásmido expresante de VEGF-2, que muestra una leve mejoría clínica en el seguimiento.
   Vale publicó el primer estudio randomizado con terapia génica y VEGF, aunque solo incluyó a 6 pacientes. Aplicaron el vector a nivel intramiocárdico de forma percutánea. No observaron efectos adversos, y los pacientes tratados con VEGF presentaron mejoría clínica respecto a los tratados con inyección de placebo. Más recientemente, se ha publicado el estudio KAT que incluye 103 pacientes, los que, a continuación de implantarles un stent coronario, se randomizaban a terapia génica con adenovirus-VEGF, plásmido-VEGF o placebo, mediante infusión intracoronaria. A los 6 meses de seguimiento no se objetivaron efectos adversos ni restenosis en los grupos de tratamiento. Además el grupo tratado con adv-VEGF presentó una mejoría significativa en la perfusión miocárdica al compararlo con los otros dos grupos.

Otros factores de crecimiento angiogénico utilizados con terapia génica
   A nivel experimental, el factor inducible por la isquemia 1a (HIF 1a) transfectado con un plásmido ha demostrado estimular al gen regulador de la síntesis del VEGF y la angiogénesis. En el momento actual se está realizando un estudio clínico con este factor, que todavía no ha sido publicado (15). El factor de crecimiento hepatocitario (HGF) transfectado utilizando un adenovirus ha demostrado a nivel experimental, no sólo estimular la angiogénesis en zonas isquémicas, sino que además ha evitado la apoptosis, adelgazamiento de las paredes necróticas, dilatación de cavidades y disfunción sistólica tras infarto de miocardio.
   Un nuevo enfoque en angiogénesis terapéutica con terapia génica puede constituirlo un estudio recientemente publicado que ha mostrado el efecto proangiogénico logrado al transfectar la cadena genética de la eNOS (óxido nítrico sintasa) utilizando un plásmido en ratas. En este trabajo se observó un aumento del óxido nítrico, acompañado de un aumento de VEGF y neovasos en los animales transfectados.

Efectos indeseados de la terapia génica con factores de crecimiento
   Los efectos deletéreos a nivel sistémico que se han asociado al VEGF son la presencia de hipotensión mediada por la liberación de óxido nítrico. Este efecto adverso normalmente se ha relacionado con su aplicación sistémica en forma de proteína.
   Respecto a los efectos deletéreos vasculares, especialmente de la terapia génica con VEGF, destaca la formación de angiomas vasculares. Schwarz en un trabajo en el que pretendían evaluar el efecto angiogénico del VEGF 165 expresado a través de un plásmido y aplicado mediante inyecciones en ratas con un infarto, observó que los animales randomizados al tratamiento activo tenían una mayor mortalidad precoz y en el estudio histológico presentaban estructuras angiomatosas a nivel epicárdico, que eran fácilmente identificables macroscópicamente en las zonas donde se había aplicado el factor. Resultados similares en cuanto a la formación de estructuras angiomatosas se han encontrado al aplicar mioblastos transfectados genéticamente con un adenovirus expresante de VEGF en el corazón no isquémico de ratas. Nosotros, en un estudio comentado previamente, también observamos estructuras angiomatosas a nivel microscópico y que afectaban a una pequeña proporción del ventrículo (18).
   Otro posible efecto deletéreo es la aceleración de la aterogénesis. La estimulación de la angiogénesis se asocia a un incremento de la formación de neoíntima, que puede acelerar el proceso aterogénico, pero además la formación de vasa vasorum en la pared vascular puede llevar a rotura de la placa, trombosis añadida e infarto de miocardio.

Angiogénesis terapeútica mediante el trasplante de células madre
   La aplicación de células madre (stem cells) adultas para la angiogénesis terapeútica parte del hallazgo de Ashara que confirmó la existencia de células progenitoras endoteliales (endothelial progenitor cells, EPC), derivadas de la médula ósea, circulantes por la sangre periférica y responsables de la vasculogénesis en adultos, es decir, que las células madre son responsables de la formación de nuevos vasos en la edad adulta. Este mismo grupo describió posteriormente cómo la isquemia, citokinas, o el VEGF aumentan la movilización de las EPCs desde la médula ósea y a su vez la formación de nuevos vasos con estas células. También se ha conseguido obtener células endoteliales a partir de células madre embrionarias utilizando anticuerpos frente al PECAM-1 (platelet endothelial cell-adhesion molecule-1), aunque dadas la implicaciones éticas así como dificultades técnicas e inmunológicas, su aplicación para la angiogénesis terapeútica sería menor.
   A nivel experimental, diversos grupos celulares han mostrado su utilidad para la angiogénesis terapeútica (19). La implantación de células mononucleares de la médula ósea en un miocardio isquémico ha demostrado aumentar la perfusión por colaterales, la contractilidad segmentaria y la densidad de neovasos en el miocardio tratado. Este efecto angiogénico puede atribuirse a la capacidad de estas células para secretar sustancias angiogénicas (VEGF, FGF, angiopoyetina-1) y citokinas (MCP-1, IL-1b, TNF-a), así como a su capacidad de incorporarse a los neovasos. También, la implantación en un miocardio isquémico de células mononucleares aisladas en sangre periférica ha mostrado aumentar la neovascularización, aunque de forma menos eficaz que las células mononucleares de la médula ósea. Una subpoblación de las células mononucleares de médula ósea son las células madre mesenquimales, que se aíslan y multiplican a partir de médula ósea utilizando técnicas de selección y cultivo celular. Éstas también han demostrado, al inyectarlas en miocardio infartado, mejorar la función sistólica y aumentar la densidad vascular. Otro tipo celular son las EPCs, cuya aplicación a nivel sistémico (mediante inyección endovenosa) tras expandirlas en cultivo, ha demostrado anidar en el miocardio isquémico, mejorar la función sistólica y estimular la angiogénesis.
   Los estudios clínicos con células madre publicados actualmente tienen como objetivo primario valorar la seguridad del tratamiento y estudiar el efecto de éstas sobre la función y diámetros ventriculares. Además, alguno de estos estudios han objetivado una mejoría en la perfusión miocárdica que apunta hacia el efecto proangiogénico de este tratamiento. Tse implantó en endocardio, por vía percutánea, células mononucleares de médula ósea a 8 pacientes con enfermedad isquémica severa. En el seguimiento a los 3 meses, no se detectaron efectos adversos y se objetivó una mejoría clínica y de la perfusión miocárdica en el territorio tratado. El estudio TOPCARE-AMI, evalúa el efecto de células EPCs circulantes y células de médula ósea infundidas por vía intracoronaria, y demostró una mejoría de la perfusión en las zonas tratados.


CONCLUSIONES

   El desarrollo de nuevos tratamientos encaminados a aumentar el aporte sanguíneo del corazón isquémico continúa siendo un reto para los investigadores en el campo cardiovascular. Inicialmente, la RTML, por medio de un proceso inflamatorio, conseguía estimular la síntesis de neovasos. Posteriormente, la aplicación de factores de crecimiento, de forma más directa, lograba el objetivo de aumentar la densidad vascular. La aplicación de la terapia génica, nos ha permitido mantener la síntesis endógena de un factor de crecimiento durante un periodo de tiempo, lo que se ha trasladado en excelentes respuestas angiogénicas en los territorios tratados, tanto es así que en algún caso llegaron a formarse angiomas, lo que nos obliga a ser cautos, especialmente con vectores que originan transfecciones duraderas. Por último, el trasplante celular nos ha permitido implantar directamente las células que formarán los nuevos vasos en el territorio isquémico, lo cual a priori, es muy alentador. En la actualidad, parece que el futuro pueda estar en desarrollar sustancias (como el factor 1 derivado de las células estromales) que ayuden a generar mayor número de estas células madre por el propio organismo y facilitar que encuentren su camino hasta el miocardio isquémico o necrótico. De cualquier forma, como dice la canción, y parafrasea el editor de Circulation, James T. Willerson, en un reciente artículo (19) “the future's so bright, [we've] gotta wear shades!” (¡el futuro es tan brillante, que deberíamos llevar gafas de sol!) (20-21).

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