REVISTA ARGENTINA DE CIRUGÍA CARDIOVASCULAR
Vol. II - N° 1/ Marzo - Abril - Mayo 2004

ARTÍCULO ORIGINAL
CÉLULAS MADRE NO MEDULARES PARA LA TERAPIA CELULAR DE LA CARDIOPATÍA ISQUÉMICA

RESUMEN

   La posibilidad de utilizar células madre para regenerar o mejorar la función del corazón isquémico, en especial después de un infarto, es objeto actualmente de numerosos estudios. Se basan en la utilización de diferentes tipos de progenitores, injertados en forma directa en el miocardio lesionado o inyectados en la circulación.
   Lo ideal es que las células injertadas contribuyan a la contracción sincrónica, integrándose anatómicamente a las fibras miocárdicas pre-existentes. En este diseño, es teóricamente posible recurrir a las células naturalmente contráctiles (células del tejido cardíaco o células musculares esqueléticas) o a células que pueden ser orientadas hacia un fenotipo contráctil (células madre embrionarias, células madre adultas de la médula ósea o de tejidos no medulares).
(Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 2:16-23)

Palabras clave
Cardiomioplastía celular - Células madre - Cardiomiopatía isquémica

RESUMO

CÉLULAS-MÃE NÃO MEDULARES PARA A TERAPIA CELULAR DA CARDIOPATIA ISQUÊMICA

   A possibilidade de utilizar células-mãe para regenerar ou melhorar a função do coração isquêmico, principalmente depois de um infarto, é objeto atualmente de numerosos estúdios. Baseiam-se na utilização de diferentes tipos de progenitores, inseridos diretamente no miocárdio lesado ou inseridos na circulação.
   O ideal é que as células iseridas contribuam à contração sincrônica, integrando-se anatomicamente às fibras miocárdicas pré-existentes. Neste desenho, é teoricamente possível recorrer às células naturalmente contrácteis (células do tecido cardíaco ou células musculares esqueléticas) ou às células que podem ser orientadas até um fenótipo contráctil (células-mãe embrionárias, células-mãe adultas da médula óssea ou de tecidos não medulares).
(Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 2:16-23)

Palavras-chave
Cardiomioplastia celular - Células-mãe - Cardiomiopatia isquêmica

SUMMARY

ANON MEDULLAR MOTHER CELLS FOR CELULAR THERAPY IN ISCHEMIC CARDIOPATHY

   The possibility of using mother cells for regeneration or improving of ischemic heart functioning, mostly after heart failure, is presently being analyzed by many studies. These studies are based on using different types of cell progenitors, directly grafted into the damaged myocardium or injected through the blood flow.
   The aim is that the grafted cells help the sinchronic contraction, incorporating themselves anatomically to the already existing myocardic fibers. Within this outline, it is theoretically feasible to turn to naturally contractile cells (cardiac tissue cells or scheletic muscular cells) or to cells that may be directed towards a contractile phenotype (embrionary mother cells, adult mother cells from bone marrow or non medullar tissues).
(Rev Arg Cir Cardiovasc 2004; 2:16-23)

Key words
Cellular cardiomyoplasty - Stem cells - Ischemic cardiomyopathy

INTRODUCCIÓN

  La posibilidad de utilizar células madre para regenerar o mejorar la función del corazón isquémico, en especial después de un infarto, es objeto actualmente de numerosos estudios (1-2). Se basan en la utilización de diferentes tipos de progenitores (Tabla 1), injertados en forma directa en el miocardio lesionado o inyectados en la circulación. El objetivo general es que las células trasplantadas (Tabla 2), alogénicas o autólogas, se diferencien en miocitos y participen en la mejoría funcional de los ventrículos afectados. Lo ideal es que las células injertadas contribuyan a la contracción sincrónica, integrándose anatómicamente a las fibras miocárdicas pre-existentes. En este diseño, es teóricamente posible recurrir a las células naturalmente contráctiles (células del tejido cardíaco o células musculares esqueléticas) o a células que pueden ser orientadas hacia un fenotipo contráctil (células madre embrionarias, células madre adultas de la médula ósea o de tejidos no medulares).

EL TEJIDO CARDÍACO

    En los modelos animales, la posibilidad de realizar terapia celular utilizando cardiomiocitos ha sido estudiada desde 1993 con la línea AT1 (3). Los cardiomiocitos del corazón adulto se consideraron durante mucho tiempo incapaces de replicarse. Por esta razón, los estudios iniciales emplearon cardiomiocitos de origen embrionario o fetal. Varios trabajos realizados en ratas muestran el éxito de los injertos de cardiomiocitos embrionarios en corazones normales o lesionados (4). Sin embargo, otros estudios indican que los cardiomiocitos injertados conservan su fenotipo embrionario y no forman uniones con los cardiomiocitos del receptor (5). Es interesante destacar que el trasplante simultáneo de células madre mesenquimales medulares y cardiomiocitos fetales humanos parece ser más eficaz que el trasplante simple de células mesenquimales en la mejoría de la función cardíaca, después de un infarto agudo de miocardio en el cerdo (6).
   Varios trabajos estudiaron la utilización de cardiomiocitos aislados en el periodo neonatal. Estos cardiomiocitos del recién nacido parecen formar uniones celulares con el miocardio del receptor, pero sufren una muerte celular importante al poco tiempo de injertarse, encontrándose después aislados en un tejido cicatricial (7). Este fenómeno está relacionado probablemente con los fenómenos inflamatorios y necróticos que ocurren después del infarto.
    Así, para algunos autores, el trasplante de cardiomiocitos podría ser más eficaz en las miocardiopatías dilatadas (8). En cualquier caso, la utilización de cardiomiocitos no adultos plantea problemas éticos mayores y el empleo de cardiomiocitos maduros abre una vía de investigación diferente.
    Desde hace varios años, se piensa que existe una débil capacidad de proliferación de los miocitos en el corazón postnatal (9). Los cardiomiocitos en mitosis representan aproximadamente 14 células/millón en el corazón normal, multiplicándose por 10 en el caso de un infarto agudo de miocardio. Se calculó que en el ventrículo izquierdo de un hombre de 45 años hay cerca de 5 x 109 focos de miocitos con un índice mitótico de 14 focos/106 células, lo que significa que 81.000 focos están en mitosis en un momento dado. Las mitosis duran aproximadamente una hora y un número importante de nuevos miocitos son producidos anualmente. Como existe también una pérdida progresiva de miocitos, estimada en 6.4 x 106 cardiomiocitos cada año, probablemente se produce a lo largo de toda la vida un turn-over lento de cardiomiocitos.
    Aunque el estudio postmortem de los corazones muestra que la multiplicación de los cardiomiocitos está aumentada en forma significativa después del infarto, desde un punto de vista clínico esta proliferación parece incapaz de restaurar el músculo dañado (10). Sin embargo, la identificación de una población de cardiomiocitos que proliferan en el corazón adulto abre la posibilidad de estimularlos in vivo o aislarlos y multiplicarlos ex vivo para trasplantarlos en las regiones infartadas (11). Varios estudios están en fase de realización para determinar con precisión los mecanismos celulares y secretores que regulan la multiplicación de los cardiomiocitos desde el nacimiento.

TEJIDO MUSCULAR

   Durante la formación del tejido muscular, precursores mononucleares y quiescentes, los mioblastos, son activados, proliferan, se diferencian y fusionan para formar las células musculares multinucleares, los miotubos. Estos miotubos sufren una diferenciación terminal y, cuando están inervados, forman las miofibrillas funcionales. Los mioblastos parecen derivarse de células localizadas en la superficie de las miofibrillas, debajo de la membrana basal, motivo por el que se denominan células satélites. Después del nacimiento, las células satélites están normalmente quiescentes y son activadas como respuesta al crecimiento o a una lesión muscular. Se ha propuesto que las células satélites contienen una subpoblación celular con las características de célula madre (12). De hecho, las células extraídas del músculo utilizando las técnicas de aislamiento y cultivo de las células satélites, pueden generar células sanguíneas. No se sabe todavía, si se trata de una plasticidad real de las células madre musculares o de una contaminación por precursores hematopoyéticos (13).
    Aunque las células satélites se han considerado clásicamente como la fuente de los mioblastos del músculo después del nacimiento, investigaciones recientes plantean la posibilidad de un origen de los mioblastos a partir de fuentes no miogénicas in vivo: fibroblastos, células madre mesenquimales de los tejidos o circulantes desde la médula ósea, miofibroblastos, células vasculares, células madre neurales.
    Los primeros intentos de reparación del corazón lesionado con músculo esquelético han consistido en las cardiomioplastías dinámicas con el músculo latissimus dorsi, con éxitos variables. Paralelamente, se han desarrollado técnicas de terapia celular utilizando precursores de las células musculares (14).
   Estas células tienen varias ventajas desde un punto de vista clínico:
   * Son células autólogas que no precisan tratamiento inmunosupresor.
   * Poseen una gran capacidad de multiplicación in vitro.
   * Su transformación en células miogénicas bien diferenciadas reduce considerablemente el desarrollo de tumores.
   Su resistencia a la isquemia les confiere una supervivencia mayor en el tejido cicatricial producido por el infarto (1).
   Las primeras experiencias de factibilidad desde 1993 han recurrido a líneas celulares de mioblastos (3) y, posteriormente, a mioblastos autólogos en estudios experimentales y clínicos (15). Después de la extracción del músculo esquelético, obtenido por biopsia de la extremidad, y de la expansión en cultivo, los mioblastos son trasplantados en el músculo cardíaco, inyectados en la circulación (15) o, directamente, en la circulación coronaria (16). Antes de iniciarse los ensayos clínicos, se han utilizado numerosos modelos animales, en especial conejos, perros y cerdos (17).
   Cualquiera que sea el método utilizado, el objetivo es obtener el acoplamiento electromecánico, a través de uniones comunicantes, entre los mioblastos injertados y los miocitos vecinos (18). Para facilitar los estudios histológicos, las células trasplantadas fueron marcadas. Así, el equipo de R.C.J. Chiu utiliza los mioblastos esqueléticos autólogos marcados con DAPI, inyectados en el ventrículo izquierdo de ratones Lewis. Tras una semana, las células marcadas están indiferenciadas, pero se observa expresión de la conexina -43 en los puntos de contacto entre las células trasplantadas y los miocitos nativos. Después de 4-6 semanas, miocitos marcados, completamente diferenciados, se interconectan y disponen en forma paralela a los miocitos nativos (19). Sin embargo, el equipo de Reinecke, luego de marcar las células injertadas con BrdU, en un modelo experimental idéntico, no halla ni el fenotipo cardiomiocitario, ni signos de acoplamiento electromecánico (20). Otra técnica consiste en medir directamente los potenciales eléctricos en los tejidos injertados: los primeros resultados muestran que los mioblastos trasplantados en el miocardio están aislados desde un punto de vista electromecánico (21).
   A pesar de estos resultados contradictorios, el trasplante de los mioblastos esqueléticos mejora la función ventricular izquierda, tanto en los pequeños animales como en los grandes (22). Se pudo demostrar también que el tratamiento previo de los mioblastos con choque térmico mejora su supervivencia (23), que existe una relación entre el número de células trasplantadas y la mejoría de la función cardíaca (24) y que esta mejoría se mantiene por lo menos durante un año (25).
   Estos resultados esperanzadores han conducido a la realización de un primer estudio fase I, mostrando que el trasplante de mioblastos autólogos en la región infartada, asociado a cirugía de revascularización coronaria, produce un engrosamiento de la pared y una revascularización. Sin embargo, 4 de los 10 pacientes tratados han desa-rrollado arritmias severas, necesitando la implantación de un desfibrilador automático (¿actividad eléctrica ectópica de los mioblastos trasplantados que no se integran en el miocardio receptor vía contactos celulares?). Un estudio más amplio que acaba de iniciarse debe dar la respuesta a varios interrogantes: tipo óptimo de las células injertadas, mecanismo de mejoría de la función cardíaca (mejoría de la contractilidad y/o limitación y remodelado de la zona infartada), optimización de la supervivencia celular (1). Otro estudio fase I ha incluido 5 pacientes en lista de espera para trasplante cardíaco, a los que se les implantó una asistencia ventricular izquierda como “puente”; después de la cardiectomía, durante la realización del trasplante, el estudio histológico ha mostrado que los mioblastos trasplantados se han diferenciado en miotubos y permanecen viables en el seno del tejido cicatricial (26).

CÉLULAS EMBRIONARIAS

   Las células madre embrionarias derivan de la masa interna del blastocito. Pueden constituir una fuente importante de células debido a su gran plasticidad y a su posibilidad de diferenciación en todos los tipos celulares del organismo. Sin embargo, los problemas éticos mayores sobre las células embrionarias humanas limitan su desarrollo y las aplicaciones terapéuticas.

Células madre embrionarias de ratas
   Son las mejor conocidas. En el terreno cardiovascular, las células madre embrionarias de rata pueden diferenciarse a cardiomiocitos (27), células endoteliales y células musculares lisas vasculares (28). Los cardiomiocitos así obtenidos se asemejan a los cardiomiocitos del tubo cardíaco embrionario (29).
   Desde 1996, se conoce que los cardiomiocitos derivados de las células madre embrionarias pueden ser trasplantados en la pared del ventrículo izquierdo de la rata, integrándose con los cardiomiocitos del receptor (30). Esta experiencia se ha repetido con la implantación de células embriona-rias de ratas en los corazones infartados de ratones, traduciéndose en una mejoría funcional durante 32 semanas desde la inducción del infarto (6). Un estudio reciente del mismo grupo muestra que el trasplante de precursores de los cardiomiocitos, derivados de células embrionarias y tratados con VEGF, es más eficaz para mejorar la función cardíaca después del infarto; probablemente este efecto esté relacionado con un incremento significativo de los vasos sanguíneos en la zona tratada (31).
   Las experiencias con injertos ectópicos permiten analizar mejor los fenómenos celulares que ocurren después del trasplante con cardiomiocitos derivados de células embrionarias. Así, tras el implante de estas células en el retroperitoneo de ratas adultas, se observan, a partir del séptimo día, latidos espontáneos con expresión celular de troponina 1, conexina 43 y antígeno nuclear de proliferación celular. Pasados 30 días, con microscopía electrónica, el tejido trasplantado está formado por cardiomiocitos con miofibrillas que poseen sarcómeras organizadas y conectadas por desmosomas, fascia adherens y gap junctions; el tejido trasplantado está vascularizado y perfundido por el receptor, lo que permite la supervivencia de los cardiomiocitos.
   La adquisición del fenotipo cardiomiocito por las células embrionarias parece necesitar la secreción de factores de la familia TGF-ß por las células cardíacas vecinas del receptor. También se ha demostrado que las células madre embrionarias pueden diferenciarse hacia varios tipos de cardiomiocito (por ejemplo célula atrial, ventricular, de Purkinje, del nodo sinusal o con actividad de marcapasos) (32). Por lo tanto, en los trasplantes celulares con cardiomiocitos derivados de células embrionarias, el injerto está formado por una mezcla de cardiomiocitos (30), lo que puede generar arritmias y deteriorar la función cardíaca a largo plazo. Los próximos estudios deben dirigirse a aislar específicamente los cardiomiocitos ventriculares para ser utilizados en el tratamiento del infarto agudo de miocardio o de la insuficiencia cardíaca crónica. Uno de los métodos puede ser la purificación celular, basada en la expresión de la cadena ligera de la miosina de 2.1 kb, específica de los cardiomiocitos ventriculares diferenciados (33).
   A pesar de su disponibilidad en cantidades ilimitadas, y de su facilidad para la multiplicación y diferenciación, las limitaciones de las células embrionarias de roedores para la terapia celular en humanos son evidentes: riesgo de rechazo inmunológico y, sobre todo, la posibilidad de desarrollar teratocarcinomas en el receptor, incluso si este hecho no se ha constatado en las ratas.

Células madre embrionarias humanas
   Las células madre derivadas de embriones humanos en la fase de blastocito poseen todas las características de las células madre embrionarias: inmortalidad, capacidad de proliferación ilimitada en cultivos manteniendo un fenotipo indiferenciado y posibilidad de formar todos los tejidos derivados de las tres capas embrionarias. Estas células pueden diferenciarse espontáneamente a cardiomiocitos y a células endoteliales (30,34) con una eficacia en la conversión menor que en las ratas. Varios factores (HGF, EGF, bFGF, TGFb1, 5 azacitidina, ácido retinoico) favorecen la diferenciación de las células embrionarias humanas en cardiomiocitos.
    Existen diferencias entre los cardiomiocitos derivados de las células embrionarias humanas y las células embrionarias de roedores. Más preocupante es que los cardiomiocitos derivados de embriones humanos no presentan el fenotipo de células diferenciadas sino el de cardiomiocitos precoces (34). Son necesarios nuevos estudios para establecer las posibilidades de aplicar la terapia celular con cardiomiocitos derivados de células embrionarias.

TEJIDO ADIPOSO

   El tejido adiposo es el más abundante del cuerpo humano. Su acceso es sencillo y en la mayoría de las personas es posible extraer varios gramos de grasa sin perjuicio estético. Desde hace mucho, el tejido adiposo obtenido quirúrgicamente o por lipoaspiración es utilizado como autoinjerto en la cirugía reconstructora. El tejido adiposo, como la médula ósea, deriva del mesénquima embrionario y contiene un estroma que puede ser aislado con facilidad. Recientemente, se ha demostrado que esta fracción estromal contiene células madre multipotentes que, como las células madre mesenquimales, pueden diferenciarse a células adipocitarias, osteogénicas y miogénicas (35). Además, células mesenquimales aisladas del tejido adiposo de conejo y cultivadas en presencia de 5-azacitidina se transforman en células del tipo de cardiomiocito: latido espontáneo después de 3 semanas, expresión de la cadena pesada de la miosina, de a-actinina y de la troponina 1 (36). En nuestro laboratorio, hemos obtenido la diferenciación espontánea a cardiomiocitos, a partir de células derivadas de los tejidos adiposos de la rata. Después del cultivo, algunas de estas células del estroma adquieren el fenotipo molecular y funcional de las células marcapasos. Posteriormente, es posible caracterizar células del tipo cardiomiocito ventricular. Este proceso de diferenciación podría ser modulado por diferentes citoquinas. Si bien estos resultados son prometedores, queda todavía un largo camino por recorrer antes de poder prever la utilización de estas células en un contexto clínico.

CÉLULAS ENDOTELIALES

    Tanto en los roedores como en el hombre, las células endoteliales pueden diferenciarse a cardiomiocitos porque se establece un contacto celular entre las células endoteliales y los cardiomiocitos existentes. Si bien las células endoteliales embrionarias y neonatales son capaces de formar cardiomiocitos, las células aisladas de los animales adultos no lo son, traduciendo una pérdida de plasticidad durante su desarrollo. Sin embargo, las células endoteliales relativamente bien diferenciadas de las venas umbilicales humanas forman cardiomiocitos, lo que permite plantear la utilización del cordón umbilical como fuente de células endoteliales humanas con una finalidad terapéutica. Otra vía de investigación consiste en multiplicar ex vivo progenitores endoteliales humanos circulantes (37).

CÉLULAS MADRE NEURALES Y HEPÁTICAS

   Los cardiomiocitos pueden formarse a partir de células madre de los tejidos neurales durante su desarrollo y en determinadas condiciones experimentales. Sin embargo, la eficacia de esta conversión es muy reducida. La línea clonal de células hepáticas WB-F344 es capaz de transformarse in vivo en cardiomiocitos después del trasplante en el corazón de ratones (37-40).
    En estos dos casos, la aplicación de esta terapia celular para el tratamiento del corazón isquémico parece poco realista.

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