REVISTA ARGENTINA DE CIRUGÍA CARDIOVASCULAR Vol. I - N° 1 / Setiembre - Octubre - Noviembre 2003

ARTÍCULO DE REVISIÓN
PERSPECTIVAS FUTURAS DE TRATAMIENTO EN LA INSUFICIENCIA CARDÍACA: UTILIZACIÓN DE CÉLULAS MADRE PARA LA REGENERACIÓN MIOCÁRDICA*

RESUMEN

   La terapia celular en la reparación miocárdica se vislumbra como una de las estrategias terapéuticas con mayor futuro en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. Numerosos estudios recientes in vivo e in vitro, apoyan la potencialidad de distintos tipos de células madre de diferenciarse hacia los tejidos necesarios para regenerar el tejido miocárdico dañado. Varios estudios en animales de experimentación sugieren que células madre de músculo (mioblastos) o médula ósea (progenitores mesenquimales, endoteliales o hematopoyéticos) podrían contribuir in vivo a mejorar la contractilidad cardíaca y han dado lugar a que diversos grupos hayan iniciado estudios en pacientes con infarto de miocardio. Sin embargo, la utilización de la terapia celular en ensayos clínicos no está desprovista de controversia, fundamentalmente relacionada con la necesidad de aumentar nuestro conocimiento antes de pasar a la aplicación clínica de estas estrategias terapéuticas. Sin entrar en valoraciones, exponemos algunas de las evidencias científicas que podrían justificar la realización de estudios de investigación clínica con terapia celular, así como algunas de las preguntas sin resolver. (Rev Arg Cir Cardiovasc 2003; 1:15-23)

Palabras clave
Insuficiencia cardíaca - Células madre - Mioblastos - Regeneración cardíaca - Trans-diferenciación

INTRODUCCIÓN

   La utilización de células como estrategia para la regeneración o reparación de tejidos es una de las áreas de investigación en biomedicina que mayor interés ha despertado en los últimos años. El concepto de la medicina regenerativa basado en la utilización de las células del propio organismo está adquiriendo cada vez más fuerza (1). Sin embargo, la aplicación de estas estrategias aún está lejos de la práctica clínica y tan sólo se han iniciado ensayos clínicos muy preliminares. En las siguientes líneas intentaremos dar una perspectiva de la situación actual de la terapia celular regenerativa cardíaca, identificando algunas de las preguntas fundamentales en este campo. Aunque joven, esta disciplina cuenta ya con numerosos hallazgos, que por razones de espacio solamente resumiremos.


Células madre, pluripotencialidad y trans-diferenciación

   Aunque el término terapia celular afecta a la utilización de células madre progenitoras, pero también de células diferenciadas, con intención terapéutica, en esta revisión nos centraremos en la utilización de células madre. Por lo tanto, es importante empezar por definir algunos conceptos en este sentido.
   Una célula madre es aquella célula que posee dos características principales:
1) Auto-renovación: capacidad de proliferar durante tiempo prolongado dando lugar a células hijas idénticas a ella.
2) Diferenciación: capacidad de diferenciarse hacia células maduras y funcionales.
   Las células madre se pueden diferenciar en función de su potencialidad, es decir, de su capacidad de diferenciarse en uno o múltiples tejidos diferentes. Mientras que las células madre totipotenciales son capaces de diferenciarse en todos los tejidos existentes en el cuerpo, así como en tejidos extraembrionarios, las células madre pluripotenciales se diferenciarán tanto en tejidos somáticos como germinales. Las células madre multipotenciales, a diferencia de las anteriores, tienen menor potencialidad, al ser capaces de diferenciarse hacia un cierto tipo de tejidos exclusivamente (2). Se acepta comúnmente que las células madre embrionarias son pluripotenciales (aquellas células madre que se obtienen a partir de la masa celular interna del blastocisto), mientras que la visión mas clásica establece que las células madre adultas (células madre obtenidas a partir de órganos del adulto, médula ósea, hígado, músculo esquelético, páncreas, etc.) son multipotenciales, es decir, su capacidad de diferenciación está más limitada, de forma tal que una célula derivada del tejido mesodérmico sólo puede dar lugar a tejidos derivados mesodérmicos. Estudios recientes parecen demostrar que las células madre obtenidas de tejidos adultos poseen mayor potencialidad de la que se creía, de tal forma que células derivadas de una capa embrionaria podrían dar lugar a tejidos derivados de otra capa embrionaria, dando lugar al concepto de versatilidad de las células madre adultas o capacidad trans-diferenciadora (3-6).


Figura 1. Ontogenia y potencialidad de las células madre. Desde el estadio de cigoto hasta la producción de células funcionales maduras, las células madre sufren un proceso de progresiva diferenciación y especialización. Estudios recientes sugieren que existe cierto grado de versatilidad en el proceso de diferenciación de tal forma que células madre derivadas de una capa embrionaria pueden generar tejidos derivados de distintas capas embrionarias (flechas dibujadas en la figura). Existe una jerarquía dentro de las células madre (ver texto).

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Células madre y regeneración cardíaca

   Como resultado de un infarto de miocardio (IM) se produce un daño irreversible del músculo cardíaco, con la consiguiente destrucción de cardiomiocitos. La fibrosis ocasionada como consecuencia del infarto, junto con los fenómenos de remodelado ventricular, conducen a la disfunción ventricular y a la insuficiencia cardíaca (7). A pesar del empleo de tratamientos como la angioplastia o los trombolíticos, capaces de eliminar la causa del IM, no existe ningún tratamiento eficaz capaz de reemplazar la cicatriz fibrosa por tejido funcional con capacidad contráctil (8). En realidad, si pensamos que el corazón es un órgano compuesto por diferentes tipos de tejidos, para conseguir la regeneración de la cicatriz secundaria a un IM sería necesario contar con la contribución de distintos tipos celulares (músculo cardíaco, células endoteliales, etc.). Numerosos grupos de investigación han demostrado a lo largo de los últimos años que existen células madre capaces de diferenciarse hacia todos estos tipos de tejidos y que, en modelos animales, estas células pueden contribuir a regenerar el miocardio dañado.
   A pesar de que las células madre embrionarias son capaces de diferenciarse a cardiomiocitos y que contribuyen a regenerar el miocardio (9), su potencial inmunogénico (10), la posibilidad de generar tumores in vivo, su potencial arritmogénico (11) y los aspectos éticos relacionados con la utilización de células embrionarias han limitado su aplicación a estudios en animales de experimentación.
   Tradicionalmente, el músculo cardíaco ha sido considerado como un órgano sin capacidad de regeneración, puesto que las fibras musculares cardíacas, o cardiomiocitos, son células totalmente diferenciadas. Sin embargo, parece evidente que el corazón humano tiene cierta capacidad de regeneración y que probablemente existan células madre de músculo cardíaco, miocitos no totalmente dife-renciados con capacidad proliferativa (12). Aunque conceptualmente importantes, estos hallazgos tienen hoy en día escasa repercusión clínica: a pesar de que los cardiomiocitos posean esta capacidad regenerativa, es improbable que contribuya de forma significativa a la regeneración cardíaca en pacientes con IM agudo (13).


Células madre de médula ósea

Estudios recientes apoyan la existencia de diferentes poblaciones celulares en la médula ósea (MO) con capacidad de diferenciarse a fibras musculares cardíacas, así como a células endoteliales, contribuyendo a la angiogénesis o vasculogénesis (14-19). En la mayoría de estos estudios los investigadores utilizaron poblaciones celulares heterogéneas, lo que limita de forma importante las conclusiones, ya que no es posible determinar cuáles son exactamente las células responsables del beneficio terapéutico. Frente a estudios en los que se han utilizado células mononucleadas de MO14, el grupo de Anversa y Orlic ha utilizado poblaciones seleccionadas de células madre hematopoyéticas de MO, pudiendo demostrar que la inyección intracardíaca de células Lin-Kit+ en la cicatriz del infarto en un modelo de IM en ratón induce colonización de la cicatriz por cardiomiocitos y estructuras vasculares derivadas de las células implantadas (18). Esta regeneración se acompaña de mejoría de la función cardíaca y de aumento de la supervivencia de los animales. En un estudio posterior, este mismo grupo ha demostrado en un modelo de infarto en ratón que el tratamiento con factores de crecimiento como SCF y G-CSF es capaz de disminuir el tamaño del infarto y mejorar la función cardíaca20. Esta mejoría se asocia con mayor proliferación de los cardiomiocitos, células de músculo liso y células endoteliales, lo que sugiere que es posible movilizar progenitores de estos tres tipos celulares a partir de la MO. A pesar de que estos estudios apoyan la existencia de células en la MO con capacidad de regenerar el tejido miocárdico dañado como consecuencia del IM mediante la movilización o administración local de células madre, el origen de las células responsables sigue sin determinarse con precisión, ya que no existen pruebas a nivel de una sola célula de que las células madre hematopoyéticas sean capaces de diferenciarse a células cardíacas. En este sentido, aunque existen trabajos que apoyan esta capacidad trans-diferenciadora (21), estudios recientes cuestionan la capacidad de las células madre hematopoyéticas de trans-diferenciarse (22).
   Además de las células madre hematopoyéticas, en la médula ósea existen progenitores y células madre angioblásticas, identificables por la presencia de una serie de marcadores y antígenos celulares como el CD34, AC133 o el receptor de VEGR tipo 2, expresados a su vez en células madre hematopoyéticas (19, 23-26).
   Estudios realizados en modelos animales de isquemia periférica e IM indican que en la MO existen células madre endoteliales con capacidad de contribuir a la neo-angiogénesis, favoreciendo la regeneración miocárdica (15,19,27,28). Estas células madre endoteliales pueden ser movilizadas a sangre periférica y contribuir a la angiogénesis en extremidades isquémicas (28). En modelos de infarto, mientras que algunos trabajos han utilizado poblaciones no seleccionadas de células mononucleadas demostrando que contribuyen a la formación de nuevos vasos en el tejido isquémico con mejoría de la función cardíaca (15), otros investigadores han utilizado poblaciones enriquecidas en progenitores endoteliales (19). En el estudio de Kocher y cols., las células CD34+ c-kit+ obtenidas a partir de sangre periférica movilizadas con G-CSF, administradas por vía intravenosa en un modelo murino de IM, aumentaron la vasculogénesis en el área del infarto, disminuyeron la apoptosis de los cardiomiocitos y mejoraron la contractilidad. Sin embargo, en este trabajo no se pudo demostrar que las células trasplantadas adquirieran características de músculo cardíaco. En este trabajo se aborda además un aspecto fundamental de este tipo de tratamientos, como es la capacidad de las células madre de dirigirse al órgano diana y anidar en él, realizando su función reparadora. La posibilidad de determinar cuáles son los mecanismos que participan en este proceso permitiría administrar las células por medio de la circulación sanguínea de forma análoga a lo que ocurre en el trasplante hematopoyético (29).
   En la MO existen además células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse a tejidos mesodérmicos como osteoblastos, condrocitos, adipocitos o músculo esquelético (30). Recientemente se ha descrito una población de células madre mesenquimales pluripotenciales denominadas MAPC, con capacidad para diferenciarse a tejidos derivados de cualquiera de las tres capas embrionarias (6, 31). Estudios recientes indican que las MSC son capaces de diferenciarse tanto in vitro como in vivo a cardiomiocitos (14,32). In vitro, el cultivo de MSC en presencia del agente desmetilante 5-azacitidina induce diferenciación hacia células con características fenotípicas y electrofi-siológicas de músculo cardíaco (33). Utilizando modelos animales de IM, varios grupos han demostrado que las células madre mesenquimales inyectadas en la cicatriz miocárdica no sólo son capaces de injertarse, sino que adquieren características de cardiomiocitos y, lo que es más importante, contribuyen a mejorar la función cardíaca (14,34).

Tipo celular	Potencialidad	Disponibilidad	Inmunoge nicidad	Limitaciones éticas	Oncogenicidad	Experiencia clínica
Mioblastos	±	+++	+++	+++	+++	+++
Cardiomiocitos
Fetales	±	±	±	±	+++	±
Adultos	±	±	+++	+++	+++	±
CM embrionarias	+++	+++	±	±	±	±
CM de médula ósea
Mesenquimales	++	+++	+++	+++	++	++
Hematopoyéticas	++	+++	+++	+++	++	+++
MAPC	+++	+++	+++	+++	+++	++
Endoteliales	++	+++	+++	+++	++	+++

Tabla 1. Características de los distintos tipos de células madre potencialmente útiles en terapia regenerativa cardíaca. +++ Favorable; ± Desfavorable. Potencialidad: capacidad de diferenciarse a distintos tipos de tejidos; Inmunogenicidad: principalmente relacionado con la posibilidad de tratamiento autólogo; Oncogenicidad: posibilidad de inducir tumores.
CM = células madre; MAPC= células madre mesenquimales pluripotenciales.

Células madre de músculo (mioblastos esqueléticos)

   Las células satélite, o mioblastos esqueléticos, son las células precursoras de las fibras musculares localizadas por debajo de la membrana basal (35-37). Aunque las células satélite se encuentran habitualmente en estado quiescente, ante la presencia de un daño muscular son capaces de proliferar y diferenciarse hacia nuevas fibras musculares (37). La posibilidad de expandir in vitro el número de progenitores musculares ha permitido realizar estudios en modelos animales de IM en los que se han implantado mioblastos, demostrando que dichas células son capaces de injertarse y terminar su proceso de diferenciación hacia fibras musculares, contribuyendo a mejorar la función cardíaca y la supervivencia de los animales (36, 38-41). Además de la inyección intracardíaca, es posible administrar los mioblastos de forma percutánea (42, 43), pues son capaces de migrar a través de la microcirculación y de integrarse en el intersticio.
   A pesar del beneficio terapéutico observado en los modelos animales, existe una importante controversia sobre si las células musculares esqueléticas implantadas en el miocardio son capaces de adquirir las características de músculo cardíaco necesarias para poder trasmitir el estímulo electromecánico. Mientras que algunos de los estudios iniciales indicaban que los mioblastos una vez implantados expresan proteínas específicas de músculo cardíaco (conexina 43 o discos intercalares) necesarias para trasmitir el estímulo electromecánico (40, 44, 45), estudios más recientes sugieren que los mioblastos no se trans-diferencian a músculo cardíaco (46). Aunque no existe aún demostración in vivo de que los mioblastos sean capaces de trasmitir el estímulo electromecánico, existen evidencias in vitro de que, al menos en ciertas circunstancias, este fenómeno sí se produce (47). En cualquier caso, la inyección de mioblastos autólogos en animales con IM ha demostrado ser eficaz y ha dado lugar al desarrollo de ensayos clínicos en pacientes con IM, como veremos a continuación.


Experiencia clínica en terapia regenerativa cardíaca

   En los últimos dos años, la acumulación de resultados derivados de los estudios preclínicos ha permitido desarrollar los primeros ensayos clínicos de factibilidad y seguridad de regeneración cardíaca con células madre. El grupo de Menasché y cols. ha sido pionero en la utilización de mioblastos esqueléticos, realizando el primer implante de mioblastos autólogos en un pacientes con un IM en junio del año 2000 (48). La estrategia diseñada por este grupo consiste en la obtención de una biopsia muscular del propio paciente 2-3 semanas antes de la cirugía de revascularización en pacientes con IM antiguo y tejido miocárdico no viable en la zona. Luego, las células cultivadas in vitro se implantan mediante inyección intramiocárdica en la región peri-infarto durante la cirugía. La eficacia del tratamiento se determinó por ecocardiografia (contractilidad cardíaca) y por PET, que permite determinar la existencia de tejido viable.
   Recientemente han aparecido los resultados de los 10 primeros pacientes sometidos a este tratamiento (49) y sugieren mejoría de la función cardíaca con aumento significativo de la fracción de eyección. Sin embargo, a pesar de que la inyección de células se realizó en zonas no revascularizadas, no es posible determinar con seguridad si el efecto es debido a la cirugía de derivación o al implante de mioblastos. Es importante destacar que en 4 de los 10 pacientes incluidos en el estudio se observaron arritmias ventriculares (taquicardia ventricular) que requirieron implantación de desfibrilador. Esta circunstancia sugiere que el tratamiento con mioblastos podría inducir arritmias (50). En este sentido, nuestro grupo ha completado una experiencia en 12 pacientes con IM antiguo y evidencia por PET de ausencia de viabilidad miocárdica sometidos a cirugía de derivación aortocoronaria en los que se han inyectado mioblastos autólogos (artículo sometido a publicación). Tras una mediana de seguimiento de 6,5 meses, no se ha observado ningún aumento de arritmias ventriculares en nuestros pacientes. Asimismo, el tratamiento se ha asociado con un aumento significativo de la contractilidad global (fracción de eyección) y, más específicamente, de la contractilidad regional de los segmentos cardíacos tratados con células frente a los segmentos que no recibieron terapia celular. Utilizando 18F-FDG y 13N-amonio también hemos podido demostrar aumento de la viabilidad en el territorio tratado con células.
   Aunque no podemos determinar los motivos que justifican las diferencias entre ambos estudios, principalmente en relación con la ausencia de arritmias cardíacas, sí es cierto que diferentes técnicas de cultivo celular e inyección (suero de ternera fetal en el cultivo e inyección de una media de 800 x 106 mioblastos en el grupo citado; suero humano autólogo y 200-300 x 106 células implantadas en nuestro grupo) pueden ser relevantes. Otros grupos han iniciado experiencias similares con mioblastos autólogos utilizando la administración directa durante la cirugía o bien la administración por vía percutánea, lo cual podría diferenciar el efecto de la cirugía de revascularización frente a la inyección de mioblastos.
   Otros grupos han utilizado células mononucleadas de médula ósea en vez de mioblastos (51,52). En el estudio realizado por Strauer y cols. se incluyeron pacientes con IM agudo a los que se les inyectaron células mononucleadas de médula ósea mediante coronariografia, a la vez que se les colocaba una endoprótesis coronaria, en el período inmediato post-infarto (51). Como grupo de control se utilizaron 10 pacientes en los que se realizó el mismo proce-dimiento terapéutico exceptuando la inyección de células. A las 10 semanas del tratamiento se observó disminución del tamaño del infarto, así como incremento de la fracción de eyección, del índice cardíaco y del volumen sistólico en comparación con los pacientes que no recibieron terapia celular. Esta mejoría de la función ventricular se asoció con aumento de la perfusión miocárdica medida radioisotópicamente. En el estudio de Tse y cols., 8 pacientes con enfermedad isquémica severa recibieron células mononucleadas de médula ósea mediante un catéter intracardíaco guiado por un sistema de mapeo cardíaco electromecánico (52). La mejoría de la perfusión y de la función cardíaca se determinó mediante resonancia magnética cardíaca.
   También se han inyectado células progenitoras de médula ósea enriquecidas en progenitores endoteliales, con la finalidad de inducir aumento de la angiogénesis y vasculogénesis en el tejido infartado que contribuya a mejorar la función cardíaca y a disminuir la apoptosis celular y el remodelado del ventrículo (16, 53). Ambos estudios se diferencian tanto en la indicación de tratamiento como en el tipo de células implantadas. En el estudio alemán (16), 20 pacientes con IM en fase aguda sometidos a reperfusión recibieron por vía intracoronaria una población heterogénea de células, incluyendo un elevado porcentaje de progenitores endoteliales de sangre periférica o de médula ósea cultivados durante 4 días in vitro. Los pacientes tratados con células mostraron mejoría de la contractilidad regional medida por ecocardiografía mediante el índice de motilidad regional.
   Asimismo, se pudo demostrar incremento de la viabilidad de la región infartada mediante PET (16). Entre las células progenitoras existentes en la médula ósea, las células que expresan el antígeno AC133 están particularmente enriquecidas en progenitores hemangioendoteliales (54). En el estudio recientemente publicado por Stamm y cols., se utilizaron células AC133 purificadas a partir de médula ósea de pacientes con un IM antiguo. Un grupo de 6 pacientes fue sometido a cirugía de derivación aortocoronaria y durante la cirugía recibieron 1,5 x 106 células AC133 directamente en el miocardio peri-infarto (53). De forma análoga a lo descrito en los otros ensayos, se produjo aumento de la contractilidad cardíaca y de la perfusión de la región infartada medida en los estudios radioisotópicos.


CONCLUSIONES

   A pesar de los numerosos estudios experimentales y clínicos publicados hasta la actualidad, es evidente la dificultad de obtener conclusiones sólidas y definitivas. El interés por la utilización de la terapia celular en la insuficiencia cardíaca se basa en las expectativas que este tipo de tratamientos genera. Sin embargo, la complejidad de la biología celular induce a enfrentarse a estos resultados con gran cautela antes de decidirnos a aplicar clínicamente este tipo de tratamientos.
   Un aspecto adicional en el que por limitaciones de espacio no vamos a extendernos es el papel de las técnicas de imagen en la determinación del beneficio terapéutico de este tipo de tratamientos (29). Hemos comentado de forma muy superficial en los distintos estudios algunas de las técnicas empleadas para determinar la eficacia de la terapia celular. También en este aspecto los avances de técnicas como el PET o la resonancia magnética juegan un papel fundamental a la hora de diseñar los estudios clínicos y experimentales.
   Quizás el mensaje más importante que deberíamos trasmitir es la necesidad de continuar investigando en esta área, facilitando la colaboración entre grupos multidisciplinares que permita llegar a responder a algunas de las preguntas pendientes: ¿cuál es la fuente ideal de células madre?, ¿los distintos tipos celulares pueden producir beneficios en diferentes situaciones?, ¿cuántas células es necesario trasplantar y por qué vía: percutánea, inyección intracardíaca directa o incluso, administración intravenosa, sería mejor administrar las células madre?, ¿cuáles son las indicaciones de la terapia celular en enfermedades cardíacas, es decir, es mejor la administración de células en la fase aguda del infarto o en infartos antiguos?, ¿es posible utilizar este tratamiento en miocardiopatias dilatadas? En definitiva, muchas más preguntas que respuestas. Sin duda, estamos ante un panorama estimulante en un nuevo campo que, seguramente, traerá soluciones y contribuirá a mejoras decisivas en la terapéutica.

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